賀占雪 馬建鵬 楊斌 趙寧

摘要 為了解云南地區(qū)不同核桃品種對(duì)葉枯病的抗性，從而為核桃抗病品種選育和葉枯病的防治提供依據(jù)，試驗(yàn)采用田間調(diào)查和離體葉片接種法獲得病斑面積和病情指數(shù)，采用聚類分析的方法對(duì)田間調(diào)查和離體接種的病斑面積進(jìn)行聚類分析，并結(jié)合病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，綜合評(píng)價(jià)云南主栽37個(gè)核桃品種對(duì)Alternaria alternata的抗病性。結(jié)果表明：‘大泡核桃1葉片上未出現(xiàn)病斑，‘小圓果病斑面積最小， 為5.05 mm2，而‘圓菠蘿2病斑面積最大，達(dá)到887.68 mm2;采用Ward最小偏差平方和法和歐式距離進(jìn)行聚類分析，其聚類效果與接種結(jié)果和田間調(diào)查結(jié)果的吻合度最好。通過(guò)田間調(diào)查和離體接種綜合評(píng)價(jià)，將37個(gè)核桃品種分為13個(gè)抗病品種、15個(gè)中抗品種、7個(gè)中感品種和2個(gè)感病品種。

關(guān)鍵詞 核桃; 葉枯病; Alternaria alternata; 抗性評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)： S 436.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018345

云南核桃栽培范圍廣、面積大、產(chǎn)量產(chǎn)值高，是云南林業(yè)產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。云南全省核桃種植面積達(dá)288萬(wàn)hm2，其中約有67萬(wàn)hm2掛果，年核桃干果產(chǎn)量達(dá)100多萬(wàn)t，產(chǎn)值超過(guò)380億元，是云南省林業(yè)產(chǎn)業(yè)中產(chǎn)值最高、效益最好、農(nóng)民得益最多的產(chǎn)業(yè)[12]。隨著人工栽培面積的擴(kuò)大，加之高效管理技術(shù)不到位，病蟲(chóng)害發(fā)生也逐漸增加。據(jù)云南省林業(yè)有害生物防治檢疫局統(tǒng)計(jì)，截至2013年底，全省核桃病蟲(chóng)害發(fā)生面積1.3萬(wàn)hm2，其中蟲(chóng)害發(fā)生面積0.7萬(wàn)hm2、病害發(fā)生面積0.6萬(wàn)hm2;2016年全國(guó)森林有害生物普查，發(fā)現(xiàn)云南核桃病蟲(chóng)害發(fā)生面積已經(jīng)超過(guò)7萬(wàn)hm2，其中病害發(fā)生4.7萬(wàn)hm2，這顯示核桃病蟲(chóng)害發(fā)展速度十分迅猛。核桃葉枯病是由Alternaria alternata引起的核桃葉部常見(jiàn)病害，是核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展中面臨的一個(gè)重要病害。該病害會(huì)降低核桃的結(jié)實(shí)量和果實(shí)飽滿度，給當(dāng)?shù)睾颂疑a(chǎn)和農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入帶來(lái)?yè)p失，嚴(yán)重制約核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

鏈格孢屬真菌是引起植物葉枯病的主要病原菌[35]，1999年Belisario等首次報(bào)道了由Alternaria alternata引起的核桃葉斑病[6]，2004年Belisario等再次報(bào)道了引起榛子和核桃葉枯病的病原是A. alternata[7]，2006年Hong等報(bào)道了A. alternata是引起歐榛和核桃葉枯病的病原[8]，2010年徐陽(yáng)等報(bào)道了新疆南疆和田墨玉縣托乎拉鄉(xiāng)的核桃葉枯病是由A. alternata引起[9]，2012年曲文文等明確危害核桃的鏈格孢菌是A. alternata[10]，2015年韓敏從新疆喀什地區(qū)分離到核桃葉枯病病原A. alternata[11]。項(xiàng)目組前期對(duì)云南省核桃病害研究時(shí)發(fā)現(xiàn)A. alternata同樣是引起核桃葉枯病的主要病原。

應(yīng)用抗病品種是防治植物病害最經(jīng)濟(jì)安全的方法，而抗病性鑒定和抗病種質(zhì)資源的篩選是品種合理利用和抗病育種工作的基礎(chǔ)[12]。余仲東等[13]采用針刺接種法對(duì)核桃枝條進(jìn)行接種試驗(yàn)評(píng)價(jià)了12個(gè)核桃品種對(duì)Botryosphaeria引起的潰瘍病的抗性;牛亞勝等[14]采用標(biāo)準(zhǔn)差法研究了20個(gè)核桃品種對(duì)黑腐病的抗病性，石進(jìn)昌等[15]采用田間試驗(yàn)法對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病進(jìn)行了抗性調(diào)查，篩選出抗性較高的品種。筆者對(duì)云南主栽的37個(gè)核桃品種對(duì)葉枯病病原Alternaria alternata抗性進(jìn)行了初步測(cè)定和評(píng)估，以期對(duì)核桃品種的引種栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：供試鏈格孢Alternaria alternata由西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

接種材料：接種用核桃樹(shù)葉片采自大理白族自治州林業(yè)科學(xué)研究所核桃種質(zhì)資源圃不同品種的嫩葉。每一供試品種選取生長(zhǎng)良好、樹(shù)勢(shì)相對(duì)一致的核桃樹(shù)，采集樹(shù)冠外圍中部健壯的發(fā)育枝中部復(fù)葉，采摘第3～4片小葉，葉寬4～5 cm，長(zhǎng)10～12 cm。種質(zhì)資源圃于2010年建成，所采集的37個(gè)核桃的品種信息如表1。

1.2 方法

1.2.1 田間調(diào)查

2017年、2018年于核桃葉部病害發(fā)病初期、盛發(fā)期和盛發(fā)后期，在云南大理、楚雄、昌寧、臨滄等地的核桃種植基地進(jìn)行核桃葉枯病田間自然發(fā)病調(diào)查。每個(gè)品種選取具有代表性的10株，每株分別從東西南北4個(gè)方向各選擇10片葉，調(diào)查葉枯病病葉的生長(zhǎng)狀況、病斑面積、病斑形狀、大小、顏色、數(shù)量等，采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑，統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)算相應(yīng)的病斑面積均值和病情指數(shù)。

病情指數(shù)=∑（病級(jí)×該級(jí)葉片數(shù)）總?cè)~片數(shù)×最高病級(jí)×100。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照苜蓿匍柄霉葉斑病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，稍有改進(jìn)[16]。

以病情指數(shù)為基礎(chǔ)，采用相對(duì)抗病性評(píng)價(jià)不同品種的抗性程度，根據(jù)病情指數(shù)并參照王瑜等[17]抗性分級(jí)研究中劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗性劃分?？共。翰∏橹笖?shù)<5;中抗：5≤病情指數(shù)≤15;中感：15<病情指數(shù)≤25;感?。翰∏橹笖?shù)>25。

1.2.2 離體接種

1.2.2.1 菌株培育及接種材料處理

鏈格孢在PDA培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)5 d后，采用3 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，備用。

供試核桃嫩葉用75%乙醇表面消毒后用無(wú)菌水沖洗3次，吸干表面水分，用石英砂在葉片正面固定部位摩擦，造成輕微傷口，備用。

1.2.2.2 接種

試驗(yàn)采集的37個(gè)核桃品種的葉片大小相近。在培養(yǎng)皿底層放入濾紙并加入無(wú)菌水使其潤(rùn)濕，將經(jīng)過(guò)處理的葉片放入培養(yǎng)皿內(nèi)，葉柄基部用浸濕的脫脂棉裹住以保持水分;然后將制好的菌餅反扣在葉片摩擦部位，以接種無(wú)菌PDA為對(duì)照，各處理重復(fù)10次。每天觀察記錄接種后葉片的發(fā)病情況。3 d后開(kāi)始按十字交叉法測(cè)量病斑直徑，直至第7天，采用第5天的數(shù)據(jù)計(jì)算病斑面積。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照黃德芬[18]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。將接種后葉片出現(xiàn)的病斑面積分為以下幾級(jí)（表3）。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所收集的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行病情指數(shù)計(jì)算，再用SPSS 22.0軟件進(jìn)行聚類分析。根據(jù)所測(cè)量的直徑計(jì)算出病斑面積，然后去掉病斑面積數(shù)據(jù)的最大值和最小值，依次進(jìn)行以下6種處理：不轉(zhuǎn)換、對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換、平方根轉(zhuǎn)換、中心化轉(zhuǎn)換、規(guī)格化轉(zhuǎn)換以及標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換;聚類方法采用組間連接法、組內(nèi)連接法、最近距離法、最遠(yuǎn)距離法、重心法、中位數(shù)法、Ward最小偏差平方和法等7種方法;聚類距離采用歐氏距離。將數(shù)據(jù)處理方法、聚類方法和聚類距離分別組合進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，依據(jù)接種后的平均病斑面積和聚類分析結(jié)果，篩選出最適合的聚類分析方法。

1.3 抗性評(píng)價(jià)

根據(jù)田間調(diào)查和離體接種的結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)合病情指數(shù)分級(jí)，對(duì)37個(gè)核桃品種對(duì)Alternaria alternata的抗性進(jìn)行劃分。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間調(diào)查抗性評(píng)價(jià)

由表4可以看出，37個(gè)核桃品種的病情指數(shù)在2.5～32.6范圍內(nèi)。病情指數(shù)是反映不同核桃品種抗病性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，根據(jù)病情指數(shù)劃分37個(gè)核桃品種的抗病性：抗病品種13個(gè)，占35.13%;中抗品種16個(gè)，占43.24%;中感品種6個(gè)，占16.22%;感病品種2個(gè)，占5.40%。

按病斑面積均值，對(duì)37個(gè)品種進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果顯示，將各重復(fù)病斑平均面積原始數(shù)值不作轉(zhuǎn)換、聚類方法采用Ward最小偏差平方和法、聚類距離采用歐式距離，所得聚類結(jié)果與田間調(diào)查病情指數(shù)劃分結(jié)果吻合度最好，符合田間調(diào)查病斑大小的分布規(guī)律。據(jù)此，以歐式距離5作為聚類分割點(diǎn)，將37個(gè)核桃品種分為4類，第1類13個(gè)抗病品種;第2類16個(gè)中抗品種;第3類6個(gè)中感品種;第4類2個(gè)感病品種（圖1）。

2.2 離體鑒定抗性評(píng)價(jià)

將鏈格孢接種在37個(gè)核桃品種葉片上，測(cè)量病斑直徑，計(jì)算5 d后病斑面積，按照病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將37個(gè)核桃品種分為4類抗性等級(jí)：第1類有16個(gè)抗病品種，病斑面積在0～40.14 mm2范圍內(nèi);第2類有12個(gè)中抗品種，病斑面積在52.48～124.96 mm2范圍內(nèi);第3類有7個(gè)中感品種，病斑面積在174.76～327.44 mm2范圍內(nèi);第4類有2個(gè)感病品種，病斑面積大于840 mm2（表5）。

用離體接種葉片的病斑面積進(jìn)行聚類分析，將37個(gè)核桃品種分為4類，第1類16個(gè)抗病品種占43.24%;第2類12個(gè)中抗品種占32.43%;第3類7個(gè)中感品種占18.91%;第4類2個(gè)感病品種占540%（圖2）。

2.3 田間調(diào)查與離體接種抗病性綜合評(píng)價(jià)

表6結(jié)果顯示，兩種方法的抗病性評(píng)價(jià)結(jié)果吻合度較高，有33個(gè)品種對(duì)Alternaria alternata的抗性結(jié)果一致，占測(cè)試品種的89.2%。綜合評(píng)價(jià)后，將測(cè)試的37個(gè)品種對(duì)Alternaria alternata抗性分為4類。第1類13個(gè)抗病品種（R）：‘大泡核桃1、‘小圓果、‘三臺(tái)核桃1、‘夾棉小麻、‘紙皮核桃、‘圓菠蘿1、‘大泡核桃4、‘新新2號(hào)、‘漾雜一號(hào)、‘大泡核桃3、‘夾棉大麻、‘桐子果、‘小胖若核桃;第2類15個(gè)中抗品種（MR）：‘新翠豐、‘云新云林1、‘小泡核桃、‘方殼核桃、‘云新云林2、‘大泡核桃2、‘漾雜三號(hào)、‘青皮大泡、‘云新90303、‘四方果、‘大木瓜核桃、‘三臺(tái)核桃2、‘大包殼、‘漾雜二號(hào)、‘娘青核桃;第3類7個(gè)中感品種（MS）：‘云新高原、‘云新90306、‘漾江一號(hào)、‘細(xì)皮核桃、‘大尖嘴、‘新早豐、‘扎343;第4類2個(gè)感病品種（S）：‘云新90301、‘圓菠蘿2。

3 結(jié)論與討論

抗病性評(píng)價(jià)是植物病害防治的重要途徑，是作物抗病育種的重要基礎(chǔ)，從抗原篩選、后代選擇、直到品種推廣的全過(guò)程都離不開(kāi)抗病性評(píng)價(jià)?？剐允羌闹鳌⒉≡锖铜h(huán)境三者之間相互作用的綜合表現(xiàn)，抗病或感病是相對(duì)于特定的菌株和特定環(huán)境條件下品種的表現(xiàn)型[1922]。而聚類分析法是多種植物抗性評(píng)價(jià)方法之一，作為數(shù)據(jù)分析工具，聚類的結(jié)果滿足相同組中數(shù)據(jù)對(duì)象的差距盡可能的小，不同組中的數(shù)據(jù)差距盡可能大的鑒定方法，在各個(gè)領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用[2325]。在本次試驗(yàn)研究中使用聚類分析法，可以將試驗(yàn)樣品在抗病性方面的數(shù)量性狀按其性質(zhì)的親疏度進(jìn)行分類，從而得出不同品種的抗性分級(jí)。試驗(yàn)過(guò)程中采用SPSS 23.0軟件對(duì)室內(nèi)離體接種后的葉片病斑面積進(jìn)行聚類分析，將37個(gè)核桃品種分為抗病、中抗、中感、感病4類，并且試驗(yàn)結(jié)果與田間調(diào)查的抗病性評(píng)價(jià)結(jié)果高度吻合。陳永芳等應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析法，對(duì)橘類18個(gè)品種和其果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，明確了最優(yōu)品種，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了聚類分析可以作為選擇優(yōu)良品種的評(píng)價(jià)方法[26]。

核桃葉枯病是一種較大程度影響核桃產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的植物病害，目前主要采用化學(xué)防治，不僅污染環(huán)境，還容易產(chǎn)生抗藥性，選育和栽培抗病品種成為生產(chǎn)中防治該病安全而長(zhǎng)效的方法。本研究采用田間調(diào)查和離體接種方法評(píng)價(jià)了云南主栽的37個(gè)核桃品種對(duì)A.alternata引起的葉枯病的抗性，離體接種的結(jié)果與田間調(diào)查的結(jié)果吻合度較高，經(jīng)過(guò)綜合評(píng)價(jià)將37個(gè)核桃品種對(duì)葉枯病的抗性反應(yīng)劃分為抗病、中抗、中感、感病4個(gè)類別，其中13個(gè)品種抗病，15個(gè)品種中抗，7個(gè)品種中度感病，2個(gè)品種感病。這種方法適合于人工接種條件下核桃品種對(duì)葉枯病的抗病反應(yīng)分類。本研究結(jié)果顯示，同一核桃品種不同樹(shù)齡表現(xiàn)出了對(duì)葉枯病的不同抗性，在相同的環(huán)境因子下，隨著樹(shù)勢(shì)增強(qiáng)，抗性也相應(yīng)增強(qiáng)。本研究為今后核桃種植過(guò)程中篩選抗病基因，選育新的抗病種質(zhì)資源，進(jìn)一步優(yōu)化抗病育種和葉枯病的防治等方面提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為今后核桃新品種培育和核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）