王姍姍 劉小嬌 靳玉龍 白婷 朱明霞 王波 張文會 張玉紅
摘要本文以青稞為材料,對AFLP酶切連接、預(yù)擴增、選擇性擴增過程進行優(yōu)化。結(jié)果表明,酶切反應(yīng)條件為DNA模板200ng、限制性內(nèi)切酶EcoRI/MseI4U、酶切時間4h;連接反應(yīng)條件為連接溫度16°C,T4連接酶3U,連接時間12h以上;預(yù)擴增反應(yīng)條件為rTaq聚合酶3U、dNTP4mmol/L、鎂離子濃度1.00mmol/L;選擇性擴增反應(yīng)條件為rTaq聚合酶4U、dNTP4mmol/L、鎂離子濃度1.25mmol/L及預(yù)擴產(chǎn)物稀釋10倍。利用優(yōu)化后的AFLP體系,以藏青2000、冬青18這2個供試材料的基因組為模板,從100對引物組合中篩選出10對重復(fù)性好、穩(wěn)定性強、擴增條帶清晰、分布均勻、多態(tài)性高的引物組合,為青稞種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析提供了基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞 青稞;AFLP;PCR體系優(yōu)化;引物篩選
中圖分類號 S512.3
文獻標識碼 A
文章編號 1007-5739(2019)05-0003-04
青稞(Hordeum?vulgare)是西藏自治區(qū)的主要糧食作物,2017年產(chǎn)量達78萬t。隨著開發(fā)應(yīng)用的逐步深人,青稞在釀造產(chǎn)業(yè)、保健食品及再生能源方面顯示出極大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。青藏高原地形地貌復(fù)雜,氣候帶齊全,土壤種類繁多,區(qū)域小氣候明顯,生長環(huán)境迥異,使西藏地區(qū)青稞具有更為豐富的多樣性"。孫立軍等在9000份中國大麥栽培種中以穗部形態(tài)特征鑒定出420個變種,而中國特有300個變種,其中西藏高原的變種類型最豐富,高達60%。西藏地區(qū)青稞的多樣性是開發(fā)優(yōu)良作物的遺傳基礎(chǔ),然而隨著現(xiàn)代育種目標朝著高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良和抗逆性強的方向邁進,遺傳基礎(chǔ)單一,基因流失的現(xiàn)象日益嚴重。因此,需要廣泛收集多樣的農(nóng)家品種、地方品種及野生種,同時對現(xiàn)有的種質(zhì)資源進行深入分析。
AFLP(amplified?fragment length?polymorphism)技術(shù)是由Vos于1995年發(fā)明的一種新型分子標記技術(shù),由RFLP技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)而成回。AFLP的優(yōu)點主要表現(xiàn)為:一是DNA模板需要量少;二是不需事先了解待研究物種的基因組信息;三是穩(wěn)定性強;四是重復(fù)性好;五是覆蓋整個基因組;六是非等位基因出現(xiàn)共遷移的概率很低;七是條帶多;八是多態(tài)性高4。
AFLP被公認為是一種非常有效的理想的分子標記技術(shù),已廣泛應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)分析檢測遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究[5-8。AFLP由于可以分辨出基因組的細微差異,因而可以在“DNA指紋水平”進行個體鑒定、親緣關(guān)系及遺傳多樣性的分析9。用AFLP的3個引物就可鑒別出一個山龍眼種群96%的種子的父本10。AFLP在多個物種中用于AFLP指紋圖譜構(gòu)建及物種資源的遺傳多樣性分析,如梨、花生等。
本文根據(jù)AFLP分子標記技術(shù)穩(wěn)定性強、重復(fù)性好及多態(tài)性高的特點,對AFLP酶切連接預(yù)擴增選擇性擴增過程進行優(yōu)化,同時從100對選擇性擴增引物中篩選重復(fù)性好、穩(wěn)定性強、擴增條帶清晰分布均勻、多態(tài)性高、可用于青稞種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析的引物組合,以期為青稞遺傳改良和親本選配提供一定的理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1植物材料。試驗所選青稞品種為西藏自治區(qū)主推青稞品種,分別為春青稞藏青2000和冬青稞冬青。
1.1.2接頭和引物信息。試驗用接頭、預(yù)擴增及選擇性擴增引物(表1),均由生工生物工程有限公司合成。其中,選擇性擴增引物共10對,可形成100對引物組合。
1.2試驗方法
1.2.1青稞基因組DNA提取。在三葉期剪取青稞幼苗,采用改良版CTAB法提取DNA,用1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量并估測DNA濃度。DNA樣品在-20C下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2AFLP限制性酶切和連接。選取的限制性內(nèi)切酶組合為EcoRI/MseI,將提取純度較高的植物基因組進行限制性酶切和連接。對模板濃度EcoRI/MseI限制性酶濃度、T4連接酶濃度及酶切時間和連接時間進行優(yōu)化。
連接反應(yīng)的試驗設(shè)計為T4連接酶2U連接時間6h、T4連接酶2U連接時間12h、T4連接酶3U連接時間6h、T4連接酶3U連接時間12h;酶切反應(yīng)的試驗設(shè)計見表2。
1.2.3AFLP預(yù)擴增。以酶切連接產(chǎn)物為模板,進行預(yù)擴增,并對rTaq聚合酶濃度、鎂離子濃度和dNTP濃度進行優(yōu)化,試驗設(shè)計方案見表3。
PCR擴增程序:949C預(yù)變性3min;94C變性45s;50C復(fù)性45s,729C延伸1min,26個循環(huán)。
1.2.4AFLP選擇性擴增。用1XTE稀釋預(yù)擴增產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板,選用Touch-downPCR進行選擇性擴增,并對預(yù)擴產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、rTaq聚合酶濃度鎂離子濃度和dNTP濃度進行優(yōu)化,試驗設(shè)計方案見表4。
PCR擴增程序:95C預(yù)變性5min;95C變性35s,65C復(fù)性35s(每循環(huán)降低0.7C),72C延伸1min,12個循環(huán);94C變性30s,56C復(fù)性30s,72C延伸1min,23個循環(huán)。
1.2.5變性電泳。選擇擴增PCR產(chǎn)物,94C變性10min后進行6%變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分析,銀染后觀察,檢測引物擴增效果。
2結(jié)果與分析
2.1青稞基因組DNA提取與檢測
DNA質(zhì)量直接影響到AFLP的酶切連接過程,將提取的基因組DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳后顯像,條帶壓縮緊密,沒有拖尾現(xiàn)象,并且條帶與入DNA條帶一致(圖1)。表明DNA質(zhì)量能夠滿足AFLP的試驗要求,也說明采用的DNA,提取方法適合青稞基因組DNA的提取。
2.2青稞AFLP酶切反應(yīng)條件篩選