張奇 沈陽市鐵西區(qū)衛(wèi)生健康服務(wù)與行政執(zhí)法中心(沈陽市鐵西區(qū)疾病預(yù)防控制中心) (遼寧 沈陽 110021)
內(nèi)容提要: 目的:探究高效液相色譜儀測定HbA2/HbF的影響因素的定性定量指標(biāo)。方法:選取40例血紅蛋白病檢測樣本。根據(jù)采集順序的不同,將其分為1、2兩個(gè)組進(jìn)行有效研究。測定人全血中HbA2/HbF的百分含量。并結(jié)合實(shí)際情況,分析洗脫時(shí)間,峰形的測值的影響因素。使用D-10 Dual Program儀器的地中海地貧模式,采用高效液相色譜儀測定(HPLC)方式檢測。一組使用直接上樣的方式,另外一組使用的是血紅蛋白液上樣。結(jié)果:樣本條件的影響,一部分全血使用的是全血上樣的模式1:300的比例稀釋,一部分是以1:200比例稀釋樣血紅蛋白液的模式進(jìn)行上樣,進(jìn)行分析。檢驗(yàn)證明,1:200的比例的血紅蛋白上樣中,上樣分析效果明顯優(yōu)于1:300的比例的全血樣本。以上檢驗(yàn)需要控制面積需要保持在100000~4000000μvolt.范圍內(nèi),避免堵塞情況呈現(xiàn)。并且峰值過飽和情況的檢測是不精確的,需用堿變性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,或者需倍比稀釋或梯度稀釋樣本再行測定。異常血紅蛋白病的峰形圖會有特征性變化,比如:時(shí)間處于0.37min的時(shí)候,unknown的數(shù)值,血紅蛋白S-Window值等就會呈現(xiàn)。兩組資料的基本情況無明顯差異(P<0.05)。結(jié)論:樣本稀釋度的大小,直接影響了地中海貧血模式橫掃面積,并影響了HbA2/HbF的測定值。峰值過飽和的情況下,需用堿變性法進(jìn)行驗(yàn)證。并且對異常血紅蛋白病峰形的觀察,可以對地貧基因的探究起到一個(gè)較好的提示性作用。
近年來,高效液相色譜儀測定(HPLC)技術(shù)不斷進(jìn)步,其中,HbA2定量分析是目前被廣泛認(rèn)可的檢測技術(shù)。本文按照HbA2/HbF的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行探究,主要分析HPLC檢測中容易被忽視的影響因素[1]。探究全血中HbA2/HbF的百分量,使用在D-10Dual Program 儀器地中海貧血模式,利用高效液相色譜儀測定,對上樣樣本制備,觀察分析洗脫的時(shí)間與血紅蛋白峰形,影響結(jié)果的相關(guān)干擾因素,進(jìn)而進(jìn)行有效對比分析[2]。
選取40例血紅蛋白病檢測樣本。根據(jù)采集順序的不同,將其分為1、2兩個(gè)組進(jìn)行有效研究。測定人全血中HbA2/HbF的百分含量。并結(jié)合實(shí)際情況,分析洗脫時(shí)間,峰形的測值的影響因素。使用D-10 Dual Program儀器的地中海地貧模式,采用HPLC方式檢測。一組,使用直接上樣的方式,另外一組使用的是血紅蛋白液上樣。兩組資料的基本情況無明顯差異(P<0.05),本次研究具有可比性。
此次樣本人員在探究的樣本構(gòu)建之前,需要進(jìn)行樣本前的處理。1組直接上樣,2組血紅蛋白液上樣。其中,血紅蛋白的制備過程,主要以生理鹽水清洗方式3次,然后取壓積紅細(xì)胞,接著按照比例加入等量的雙蒸水,搖勻。再加上1/2的四氯化碳,在混合震蕩的情況下保持1min,靜止10min[3]。這個(gè)時(shí)候的離心率2000r/min,需要保持15min以上,接著吸取上清液,就可以提取到大約10%左右的血紅蛋白液。樣本處理好了之后,就需要進(jìn)行HbA2/HbF定量測定[4]。接著利用HPLC的方式,一個(gè)部分是1:200的比例,血紅蛋白上樣,一個(gè)部分是1:300的比例,直接上樣,按照參照對比的方式,分析HbA2/HbF的數(shù)值,進(jìn)行平行分析。這個(gè)時(shí)候就可以根據(jù)實(shí)際情況,探究洗脫的時(shí)間與血紅蛋白峰形,對影響結(jié)果的相關(guān)干擾因素進(jìn)行有效對比分析[5]。
探究高效液相色譜儀直接上樣與血紅蛋白液上樣中,洗脫的時(shí)間與血紅蛋白峰形,影響結(jié)果的相關(guān)干擾因素進(jìn)行有效對比分析。
使用SPSS 23.0軟件對研究得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,得到的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用±s來進(jìn)行表示,用t來對計(jì)量資料檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)則通過χ2,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6]。
1組與2組樣本直接上樣與血紅蛋白液上樣HPLC法檢測結(jié)果對比中1組有9例患者結(jié)果峰面積高于或者低于在100000~4000000μvolt.范圍內(nèi)。然而,2組上樣的結(jié)果峰面積全部控制在100000~4000000μvolt.范圍內(nèi),符合標(biāo)準(zhǔn)化的要求。因此,對樣本條件的影響,35例中是1:200的比例,一個(gè)部分是1:300的比例,接著使用直接上樣和血紅蛋白上樣的形式,進(jìn)行分析。檢驗(yàn)證明,1:200的比例的全血樣本中,上樣分析效果明顯優(yōu)于1:300的比例的全血樣本,見表1。
表1.1組與2組樣本直接上樣與血紅蛋白液上樣HPLC法檢測結(jié)果對比(n)
針對于隨機(jī)40例的全血樣本取樣中,按照時(shí)間的順序,分為1、2兩組,1組直接上樣,2組血紅蛋白液上樣。首先,樣本條件的影響中,分別使用是1:200的比例和1:300的比例進(jìn)行上樣,換句話說就是使用血紅蛋白上樣和直接上樣的形式,進(jìn)行分析,控制面積需要保持在100000~4000000μvolt.范圍內(nèi),避免堵塞情況呈現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),1:300的比例的全血樣本,由于年齡的不同,很容易出現(xiàn)堵塞吸樣孔及標(biāo)本的情況出現(xiàn),這樣就不符合上樣的峰面積需求。1:200的比例的血紅蛋白液上樣,就符合上樣的峰面積要求。這樣就可以更好、更全面地診斷血紅蛋白病。檢驗(yàn)證明,1:200的比例的血紅蛋白上樣中,上樣分析效果明顯優(yōu)于1:300的比例的全血樣本。其中有3例測量不出HbF值,需要在堿性的控制范圍上進(jìn)行測定。經(jīng)過以上1組與2組的實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),經(jīng)前處理的血紅蛋白液上樣的樣本,比直接上樣的精確率更高。并且峰值過飽和事后的檢測是不精確的,需用堿變性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證或者,需倍比稀釋或梯度稀釋樣本再行測定。由此,HPLC在檢測HbA2/HbF的定量指標(biāo)時(shí)的干擾因素的時(shí)候,需要根據(jù)樣本的稀釋度,樣本的年齡大小,峰形的圖形等進(jìn)行有效的分析,這樣才能提升基因分析,保證確診率,實(shí)現(xiàn)有效驗(yàn)證。