洪鐘時(shí) 邱成志 王春曉 唐龍鋒 莊海濱 施澤生

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普通外科 (福建 泉州 362000)

腫瘤細(xì)胞的耐藥性主要為長(zhǎng)期治療下的獲得性化療耐藥，此種棘手的關(guān)系與人Rph受體A2基因有著密切的相關(guān)性，針對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞耐藥的研究可以從人Rph受體A2基因入手，其對(duì)接示結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制以及如何避免耐藥、優(yōu)化化療方案等有重要意義[1-2]。為此，本文通過(guò)選擇選擇中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，旨在為臨床優(yōu)化結(jié)直腸癌細(xì)胞化療方案、降低耐藥發(fā)生率提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。具體報(bào)告如下。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象 選擇中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供且本實(shí)驗(yàn)室自行傳代凍存的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株。RPMI-1640 培養(yǎng)基(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)、Optu-MEM培養(yǎng)基(上海歌凡生物科技有限公司)。胎牛血清(購(gòu)自Gibco公司。β-聯(lián)蛋白購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。神經(jīng)鈣黏素、波形蛋白(品牌：Gibco，產(chǎn)地：美國(guó))。Notch、Snail 及 β-actin 抗體購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司。CCK-8 細(xì)胞活力及增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。EphA2 siRNA 及其陰性對(duì)照 siRNA 購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。倒置相差顯微鏡 購(gòu)自Peprotech 公司。7500型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司。Matrigel、Transwell 小室均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2方法 本研究細(xì)胞總RNA抽提根據(jù)Trizol一步法進(jìn)行操作。

(1)首先采用含有10.0%新生小牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基并將人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。按照研究中的方法進(jìn)行換液、胰酶?jìng)鞔?、Real-time PCR 檢測(cè) mRNA 的表達(dá)(反向引物為 5’-TCAGACACCTTGCAGAC-CAG-3’；β-actin 作為內(nèi)參照，正向引物為 5’-ACA-GAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’，反向引物為5’-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3’)、構(gòu)建 PCR 反應(yīng)體系、分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

(2)CCK-8法：加入不同濃度5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康檢測(cè)同步化已90%融合的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株，統(tǒng)計(jì)其對(duì)化療藥物的敏感性(以半數(shù)抑制濃度IC50表示)。同時(shí)統(tǒng)計(jì)干擾EphA2的表達(dá)后統(tǒng)計(jì)人結(jié)腸耐藥細(xì)胞株對(duì)5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑的耐藥性。

(3)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，待人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株生長(zhǎng)70%融合后同步化處理以及siRNA轉(zhuǎn)染。通過(guò)制作 Eph受體A2siRNA轉(zhuǎn)染組、空白組、siRNA陰性組，將其溶解Optu-MEM培養(yǎng)基。孵育后將三組轉(zhuǎn)染混合物加入人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株。對(duì)其放置細(xì)胞培養(yǎng)箱、正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，提取細(xì)胞蛋白測(cè)定轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)直腸癌親本細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株中 Eph受體A2siRNA表達(dá)水平，同時(shí)在結(jié)直腸癌親本細(xì)胞株中不斷提高5-FU濃度，統(tǒng)計(jì) Eph受體A2siRNA表達(dá)。

(4)利用劃痕實(shí)驗(yàn)、倒置相差顯微鏡觀察在干擾 Eph受體A2后人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株的自我修復(fù)。Transwell實(shí)驗(yàn)觀察人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株染色后的數(shù)目(每組細(xì)胞包括3個(gè)視野，記錄其平均值)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)腸耐藥細(xì)胞株采用的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。半數(shù)抑制濃度IC50以Mean±SD表示，同時(shí)此類計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株、親本株化療耐藥性、交叉耐藥性分析 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果得出結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株與親本細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度IC50，兩者相比較，結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度優(yōu)于親本株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2Eph受體A2與結(jié)直腸癌細(xì)胞化療耐藥關(guān)系分析 結(jié)腸癌親本細(xì)胞株Eph受體A2蛋白表達(dá)水平(1.08±0.73)，結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株Eph受體A2蛋白表達(dá)水平(2.57±0.81)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.843，P=0.000)。此外5-氟尿嘧啶0mg/L時(shí)親本細(xì)胞株中Eph受體A2蛋白表達(dá)水平為(0.9±0.5)，5-氟尿嘧啶5mg/L時(shí)Eph受體A2蛋白表達(dá)水平為(1.2±0.7)，10mg/L時(shí)Eph受體A2蛋白表達(dá)水平為(1.9±0.8)，呈逐漸增加的水平。這兩項(xiàng)研究結(jié)果提示Eph受體A2可調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞化療耐藥性。

表1 結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株、親本株化療耐藥性、交叉耐藥性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3Eph受體A2干擾后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響 低倍顯微鏡(1X00)可發(fā)現(xiàn)干擾Eph受體A2蛋白表達(dá)水平后細(xì)胞數(shù)量在6h、12h無(wú)明顯變化，而在48h細(xì)胞壁附著能力明顯下降。

3 討論

近年來(lái)，有諸多研究表明多種因子可介導(dǎo)Notch信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其包括Notch-1蛋白、人Rph受體A2基因等[3]。雖然臨床研究證實(shí)了人Rph受體A2基因與多種腫瘤病變的相關(guān)性，但關(guān)于探究Eph受體A2在結(jié)直腸癌細(xì)胞化療耐藥中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究較少，這值得前瞻性研究深入調(diào)查[4]。

人Rph受體A2基因定位于1p36.1，有研究表明Eph基因家族是受體絡(luò)氨酸激酶中最大的亞族[5]。人Rph受體A2基因廣泛參與炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤血管形成等病理生理過(guò)程，且在結(jié)直腸癌的病理生理過(guò)程中，人Rph受體A2基因?qū)Y(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞遷移、耐藥性增加和生長(zhǎng)分化等諸多生理學(xué)過(guò)程發(fā)揮了重要作用，其表達(dá)水平與腫瘤造成的內(nèi)外微環(huán)境有一定相關(guān)性[6-7]。有研究中通過(guò)人Rph受體A2基因沉默基因抑制Rph受體A2基因表達(dá)，然后觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低，這證實(shí)了人Rph受體A2基因促使腫瘤細(xì)胞遷移等作用[8]。因此臨床研究認(rèn)為人Rph受體A2基因通過(guò)介導(dǎo)Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，并且內(nèi)皮細(xì)胞衰老以及發(fā)揮促進(jìn)腫瘤血管生成能力[9-10]。本次研究結(jié)果表明結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株中人Rph受體A2基因表達(dá)水平高于親本細(xì)胞株，且親本細(xì)胞株中人Rph受體A2基因隨著5-氟尿嘧啶劑量逐漸增加，其表達(dá)水平也明顯向升高，這表明人Rph受體A2基因具有促進(jìn)結(jié)腸癌耐藥性增加的作用，這可能與人Rph受體A2基因介導(dǎo)Notch信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞獲得間充質(zhì)樣特性，與此同時(shí)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞也失去了上皮樣特性，此過(guò)程被稱為EMT，人Rph受體A2基因與其密切相關(guān)[11-12]。

綜上所述，人Rph受體A2基因可增加結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞耐藥性，這可能與EMT有關(guān)。值得臨床重視。