新型遺傳標(biāo)記DIP-STR多重復(fù)合擴(kuò)增體系的構(gòu)建

鄭文彥，王致遠(yuǎn)，羅高司，符 晶，梁桑華，黃源堅(jiān)，錢 水*

（1.廣東華美眾源生物科技有限公司，廣東佛山528000；2.佛山市公安司法鑒定中心，廣東佛山528000）

在法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域，微量DNA及混合DNA的檢測(cè)一直是現(xiàn)場(chǎng)案件檢測(cè)的重點(diǎn)與難點(diǎn)。隨著DNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，許多微量接觸類生物檢材通過STR、SNP等遺傳標(biāo)記可以獲得穩(wěn)定可靠的DNA分型［1］。但是對(duì)于主次成分差異比較大的混合樣本，常規(guī)法醫(yī)DNA檢測(cè)方法只能提供非常有限的分型結(jié)果［2-3］。

為了克服這一難題，Castella V等［4］在2011年率先提出了一種由插入-缺失多態(tài)性（Deletion/Insertion Polymorphisms，DIP）和短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（Short Tandem Repeat,STR）兩種遺傳標(biāo)記串聯(lián)組合在一起形成的新型復(fù)合遺傳標(biāo)記DIP-STR。該遺傳標(biāo)記是STR序列上/下游500 bp范圍內(nèi)存在DIP位點(diǎn)，根據(jù)DIP位點(diǎn)的插入或缺失狀態(tài)分別設(shè)計(jì)特異性引物，利用DIP雙等位基因特異分型的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合STR的多態(tài)性優(yōu)勢(shì)，能夠在極不平衡的雙源DNA混合物中檢測(cè)出次要成分，同時(shí)保留了由連鎖的多等位基因提供的強(qiáng)大識(shí)別能力［5］。

目前，國(guó)外已有利用DIP-STR標(biāo)記檢測(cè)不均衡樣本的體系建立及案件應(yīng)用的報(bào)道。Castella V等［4］建立了由7個(gè)DIP-STR位點(diǎn)組成的復(fù)合擴(kuò)增體系。此后該團(tuán)隊(duì)陸續(xù)報(bào)道了經(jīng)過改良的DIP-STR復(fù)合擴(kuò)增體系及該體系在8宗案件上的應(yīng)用［6-7］，顯示出DIP-STR遺傳標(biāo)記能夠補(bǔ)充樣本的分型結(jié)果或?yàn)檎{(diào)查提供新線索的作用。而國(guó)內(nèi)針對(duì)DIP-STR遺傳標(biāo)記的研究起步晚、成果少，其中Tan Y等［8］在2017年選取了6個(gè)DIP-STR基因座對(duì)西南漢族人群的不平衡樣本進(jìn)行了研究。

綜合上述情況，本研究在UCSC及NCBI數(shù)據(jù)庫中查找、篩選了8個(gè)適合法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的DIPSTR組合遺傳標(biāo)記，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系，設(shè)計(jì)分析方法，通過模擬樣本評(píng)估驗(yàn)證其法醫(yī)效能，從而建立一種同時(shí)檢測(cè)人常染色體DIP和STR基因座的方法，為案件現(xiàn)場(chǎng)微量物證檢驗(yàn)中不均衡混合樣本的DNA檢測(cè)提供有效的輔助方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

擴(kuò)增目的DIP-STR位點(diǎn)的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他試劑主要包括PCR master mix和熱啟動(dòng)C-Taq酶均購(gòu)自無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照DNA 9948購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

樣本采用Mastercycler?nexus PCR儀（Eppendorf公司，德國(guó)）進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用3130XL型遺傳分析儀（ABI公司，美國(guó)）進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及標(biāo)記

通過NCBI和UCSC查找篩選及參考相關(guān)文獻(xiàn)，最終選定8個(gè)DIP-STR基因座。篩選參數(shù)包括：DIP位點(diǎn)插入/缺失片段大小為3～10 bp，STR基因座核心序列為3～5堿基，DIP與STR間距小于250 bp，DIP-STR片段大小在500 bp以內(nèi)。對(duì)每個(gè)基因座分別設(shè)計(jì)兩條帶有不同熒光的用于識(shí)別DIP位點(diǎn)缺失（S）/插入（L）分型的上游引物及一條普通公共下游引物，其中rs35032587-STR、rs60194384-STR、rs72406828-STR和rs2308142-STR的S上游引物為FAM標(biāo)記，L上游引物為HEX標(biāo)記；rs34212659-STR、rs146332920-STR、rs145423446-STR和rs111478323-STR的S上游引物為TAMRA標(biāo)記，L上游引物為ROX標(biāo)記。DIP-STR基因座信息如表1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物排布圖如圖1所示。

表1 DIP-STR基因座信息

圖1 DIP-STR擴(kuò)增產(chǎn)物排布圖

1.2.2 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

DIP-STR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系采用25 μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系設(shè)置，其中含有12.5 μL Reaction Mix（各組分終濃度為 50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.25 mmol/L dNTP Mix），5 μL 混合引物以及1 μL熱啟動(dòng)C-Taq酶（5 U/μL），加入1片1.2 mm人血斑樣本或0.5～2.0 ng提取的人基因組DNA，加水補(bǔ)足至25 μL，充分混勻后短暫離心。體系內(nèi)混合引物終濃度如表2所示。

表2 引物終濃度 μM

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

95℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，共10個(gè)循環(huán)；90℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共20個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.2.4 毛細(xì)管電泳檢測(cè)

將12 μL去離子甲酰胺與0.5 μL分子量?jī)?nèi)標(biāo)Marker SIZ-500（無錫中德美聯(lián)有限公司，中國(guó)）混合。再加入1 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，渦旋混勻，3 500 r/min離心2 min，95℃變性3 min，冰浴3 min，用ABI3130XL遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。運(yùn)用Gene Mapper?IDX（ABI公司，美國(guó)）軟件結(jié)合產(chǎn)物排布設(shè)置對(duì)DIP-STR位點(diǎn)分型結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合擴(kuò)增體系測(cè)試

選取兩個(gè)樣本的基因組DNA作為模板，按上述建立體系進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳，結(jié)果如圖2、3所示。以樣本1的rs72406828-STR位點(diǎn)為例（見圖2），電泳圖顯示該位點(diǎn)在FAM和HEX各出一峰，分型為S9/L8，表明此位點(diǎn)的DIP分型是缺失（S）+插入（L），S型DIP位點(diǎn)后接9重復(fù)STR，L型DIP位點(diǎn)后接8重復(fù)STR。又以樣本2的rs146332920-STR位點(diǎn)為例（見圖3），電泳圖顯示該位點(diǎn)在ROX出2個(gè)峰，而TAMRA不出峰，分型為L(zhǎng)13/L14，表明該位點(diǎn)的DIP分型是插入（L）+插入（L），L型DIP位點(diǎn)后分別接13和14重復(fù)的STR。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該復(fù)合擴(kuò)增體系擴(kuò)增單一成分樣本時(shí)能獲得清晰準(zhǔn)確的分型，且基因座間具有較好的均衡性。

圖2 樣本1 分型圖

圖3 樣本2分型圖

2.2 不均衡混合樣本測(cè)試

采用前述復(fù)合擴(kuò)增體系，模擬法醫(yī)物證現(xiàn)場(chǎng)不均衡混合樣本進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)試。對(duì)兩份實(shí)際提取樣本標(biāo)準(zhǔn)品（女性樣本與男性樣本各一份），按一定比例混合模擬不同比例的男女混合斑，以此作為擴(kuò)增模板進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳檢測(cè)。樣本混合比例分別為 1：10、1：25、1：50、1：100；10：1、25：1、50：1、100：1。

測(cè)試結(jié)果顯示，當(dāng)樣本主次成分比值在50：1以內(nèi)時(shí)，本方法能夠獲得較好的分型效果。當(dāng)兩種成分樣本的DIP-STR位點(diǎn)沒有相同的分型時(shí)，可準(zhǔn)確得出兩種樣本各自的分型（見圖4～5），其中圖4樣本分型分別為S7/S11與L12，圖5樣本分型分別為L(zhǎng)12與S11/L13；但是若混合樣本兩者的DIP-STR位點(diǎn)存在分型重合，且沒有其中一個(gè)樣本的單獨(dú)分型輔助拆分，則存在無法分辯出兩者分型的可能（見圖6）。在能夠獲得其中一個(gè)樣本的分型時(shí)，才能對(duì)混合樣本進(jìn)行拆分。

圖4 混合樣本的rs60194384-STR位點(diǎn)分型圖

圖6 混合樣本的rs2308142-STR位點(diǎn)分型圖

3 討論

DIP-STR是基因組中兩種遺傳標(biāo)記的串聯(lián)組合，它既有STR高多態(tài)性的優(yōu)勢(shì)，又有DIP雙等位基因特異分型的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)STR標(biāo)記相比，DIP-STR檢測(cè)不均衡樣本的優(yōu)勢(shì)在于：1）當(dāng)主次成分STR分型一致時(shí)，可以通過DIP位點(diǎn)加以區(qū)分；2）能夠避免將主成分的stutter峰與次成分的主峰混淆的情況發(fā)生；3）可以對(duì)主次比例更懸殊的不均衡樣本進(jìn)行分型［8］。

本研究通過設(shè)計(jì)針對(duì)DIP位點(diǎn)插入或缺失的特異性上游引物及公共下游引物，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及毛細(xì)管電泳，建立了能夠單管同時(shí)擴(kuò)增8個(gè)DIP-STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系。測(cè)試結(jié)果顯示，在檢測(cè)主次成分相差50倍以內(nèi)的不均衡樣本時(shí)能獲得較好的分型結(jié)果。此方法的建立，為法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)混合樣本的檢測(cè)提供了新思路。

然而，DIP-STR遺傳標(biāo)記在用作法醫(yī)DNA檢測(cè)的方法時(shí)仍存在一些不足之處。由于結(jié)合了兩種遺傳標(biāo)記，每個(gè)位點(diǎn)所需的分型位置增加了一倍，導(dǎo)致一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增里能夠包含的基因座比STR要少，位點(diǎn)數(shù)量有限制。再者，當(dāng)混合樣本中不同個(gè)體的DIP-STR位點(diǎn)分型出現(xiàn)重疊時(shí)，仍然存在無法區(qū)分混合成分的可能。因此，在未來的研究中，需要對(duì)這些不足進(jìn)行改進(jìn)，讓DIP-STR遺傳標(biāo)記在現(xiàn)場(chǎng)物證檢驗(yàn)的應(yīng)用更具優(yōu)勢(shì)、更有效。