6種鳶尾黃素曼尼希堿衍生物的合成及其抗腫瘤活性研究

陳帥 袁崇均 羅森 余夢瑤 王笳

中圖分類號 R284.2;Q946.91 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）21-2937-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.12

摘 要 目的：對鳶尾黃素進行結構修飾，尋求新的具有抗腫瘤活性的化合物。方法：以鳶尾黃素為先導化合物，分別加入乙醇胺、甲胺、乙胺、二甲胺、二乙胺、正丙胺等胺類試劑和甲醛溶液，經(jīng)曼尼希（Mannich）反應得到鳶尾黃素曼尼希堿衍生物，根據(jù)紅外光譜、紫外光譜、質譜、核磁共振等確定其結構。采用溶解度試驗法考察鳶尾黃素及其衍生物的水溶性;采用MTT法考察鳶尾黃素及其衍生物對人結腸癌細胞株HCT116、人肺癌細胞株A549、人肝癌細胞株HepG2的增殖抑制作用，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）;以H22肝癌荷瘤小鼠為模型，考察鳶尾黃素及其衍生物（劑量均為100 mg/kg）的體內抑瘤率。結果：共合成6個鳶尾黃素曼尼希堿衍生物，分別為8-（N-羥乙基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮、8-（N-甲基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮、8-（N，N-二乙基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮、8-（N，N-二甲基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮、8-（N-乙基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮、8-（N-正丙基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮（依次記為化合物1～6）。與鳶尾黃素比較，6個衍生物的水溶性明顯提高，溶解度是鳶尾黃素的5～20倍;其中化合物1、3、5對HCT116細胞的IC50分別為（34.82±3.27）、（16.21±4.13）、（33.12±3.25） μmol/L，均強于鳶尾黃素的IC50[（45.23±5.74） μmol/L];對A549細胞的IC50分別為（37.05±5.74）、（26.88±4.52）、（30.13±6.23） μmol/L ，均強于鳶尾黃素的IC50[（53.24±6.34） μmol/L];對HepG2細胞的IC50分別為（23.74±1.45）、（18.96±2.34）、（30.95±2.87） μmol/L ，均強于鳶尾黃素的IC50[（48.98±2.58） μmol/L];對H22肝癌荷瘤小鼠的抑瘤率分別55.51%、57.20%、49.15%，且均高于鳶尾黃素的抑瘤率（33.05%），其余3個化合物相比鳶尾黃素的抗腫瘤活性無明顯優(yōu)勢。結論：在本研究合成的6個鳶尾黃素曼尼希堿衍生物中，化合物1、3、5均具有強于鳶尾黃素的抗腫瘤活性。

關鍵詞 鳶尾黃素;胺類;曼尼希堿衍生物;合成;人結腸癌細胞株HCT116;人肺癌細胞株A549;人肝癌細胞株HepG2;半數(shù)抑制濃度;小鼠;抑瘤率

Study on Synthesis and Anti-tumor Activity of 6 Kinds of Tectorigenin Mannich Base Derivatives

CHEN Shuai，YUAN Chongjun，LUO Sen，YU Mengyao，WANG Jia（Institute of Chinese Materia Medica， Sichuan Academy of Chinese Medicine Science， Chengdu 610041， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To conduct structural modification of tectorigenin to search for new compounds with anti-tumor activity. METHODS： Tectorigenin was used as a lead compound， and then added into amine reagents as ethanolamine， methylamine， ethylamine， dimethylamine， diethylamine， n-propylamine and formaldehyde solution. Tectorigenin Mannich base derivatives were synthesized by mannich reaction with as the lead compound. The structures of the derivatives were identified according to IR， UV， MS and NMR data. Solubility of tectorigenin and its derivatives were investigated by solubility test method. MTT assay was used to investigate the inhibitory effects of tectorigenin and its derivatives on the proliferation of human colon cancer cell line HCT116， human lung cancer cell line A549 and human hepatoma cell line HepG2， and half inhibitory concentration （IC50） was calculated. The inhibition rate of tectorigenin and its derivatives （100 mg/kg） on H22 hepatoma-bearing mice in vivo was studied. RESULTS： Totally of 6 kinds of tectorigenin mannich base derivatives were synthesized， such as 8-（N-hydroxyethyl）-methyleneamino-5，7，4′-trihydroxy-6-methoxyisoflavone， 8-（N-methyl）-methyleneamino-5，7，4′-trihydroxy-6- methoxyisoflavone， 8-（N， N-diethyl）-methyleneamino-5，7，4′-trihydroxy-6-methoxyisoflavone， 8-（N， N-dimethyl）-methyleneamino- 5，7，4′-trihydroxy-6-methoxyisoflavone， 8-（N-ethyl）-methyleneamino-5，7，4′-trihydroxy-6-methoxyisoflavone， 8-（N-propyl）- methyleneamino-5，7，4′-trihydroxy-6-methoxyisoflavone （compounds 1-6 in turn）. Compared with tectorigenin， the water solubility of six derivatives was significantly improved， and the solubility was 5-20 times higher than that of tectorigenin. IC50 of compounds 1， 3 and 5 to HCT116 cells were （34.82±3.27）， （16.21±4.13）， （33.12±3.25） μmol/L， which were stronger than that of tectorigenin [（45.23±5.74） μmol/L]; IC50 of compounds 1， 3 and 5 to A549 cells were （37.05±5.74）， （26.88±4.52）， （30.13±6.23） μmol/L， which were stronger than that of tectorigenin [（53.24±6.34） μmol/L]; IC50 of compounds 1， 3 and 5 to HepG2 cells were （23.74±1.45）， （18.96±2.34）， （30.95±2.87） μmol/L， which were stronger than that of tectorigenin [（48.98±2.58） μmol/L]. Compounds 1， 3 and 5 showed higher inhibition rates （55.51%， 57.20% and 49.15%） than tectorigenin （33.05%） on H22 hepatoma-bearing mice， respectively. The other three compounds had no obvious advantage over tectorigenin in anti-tumor activity. CONCLUSIONS： In this study， compounds 1， 3 and 5 of six tectorigenin mannich base derivatives synthesized in this study have stronger antitumor activity than tectorigenin.

KEYWORDS ? Tectorigenin; Amine; Mannich base derivatives; Synthesis; Human colon cancer cell line HCT116; Human lung cancer cell line A549; Human hepatoma cell line HepG2; Half inhibitory concentration; Mice; Anti-tumor rate

鳶尾黃素（Tectorigenin）又名射干苷元、鳶尾苷元，主要存在于鳶尾科鳶尾屬和射干屬的植物根莖中[1]，為異黃酮類化合物[2]。藥理研究表明，鳶尾黃素具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗骨質疏松等藥理活性[3-16]，黃文哲等[11]研究表明鳶尾黃素對胃癌細胞和白血病細胞增殖有一定程度的抑制作用;汪新亮等[12]研究表明鳶尾黃素對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖具有明顯的抑制作用;Thelen P等[13]用射干的提取物治療裸鼠前列腺癌，結果表明其中的鳶尾黃素可調節(jié)癌基因的異常表達;Fang R等[14]研究表明鳶尾黃素具有細胞毒性，能抑制細胞分裂;Zheng M等[15]研究表明鳶尾黃素可通過抑制環(huán)氧化酶2的誘導作用而抑制血管生長因子或辛酸刺激的腹膜巨噬細胞前列腺素E2（PGE2）的產生，即可通過抑制新生血管生成，進而對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著抑制作用。潘靜[16]用MTT比色法觀察從川射干提取的異黃酮類成分對人胃癌細胞株SGC7901的作用，結果顯示鳶尾黃素對SGC7901細胞有抑制作用。但由于鳶尾黃素水溶性和脂溶性較差、腸道吸收較少，以及其C-5、C-7位羥基在體內易被糖基化的原因，顯著降低了鳶尾黃素的活性，限制了其臨床應用。因此，對鳶尾黃素進行結構修飾，可能會獲得高效、低毒的新型抗腫瘤候選藥物。

曼尼希反應（Mannich反應）是一類重要的有機反應[17-19]，是含有活潑氫的化合物與甲醛和胺縮合生成氨基化合物的有機化學反應。曼尼希堿衍生物通常具有抗腫瘤活性[19-20]，許多生物堿、核苷酸、甾族化合物、肽、抗生素和維生素均包含曼尼希堿活性片段。本文以鳶尾黃素為先導化合物，分別加入乙醇胺、甲胺、乙胺、二甲胺、二乙胺、正丙胺等胺類試劑和甲醛溶液，合成鳶尾黃素曼尼希堿衍生物，合成機制為鳶尾黃素A環(huán)8-位活性H與脂肪胺和甲醛反應，鳶尾黃素A環(huán)C-8位H被氨甲基取代，生成鳶尾黃素曼尼希堿衍生物。然后對該衍生物進行體外、體內抗腫瘤試驗，考察衍生物的抗腫瘤活性，優(yōu)選出有效的抗腫瘤化合物。鳶尾黃素曼尼希堿衍生物的合成路線見圖1。

1 材料

1.1 儀器

RRLC-6410型液質聯(lián)用儀（美國Agilent公司）;AVⅡ型核磁共振波譜（NMR）儀（德國Bruker公司）;UV-2401PC型紫外分光光度儀和FTIR8300型紅外檢測儀（日本Shimadzu公司）;WRS-2型微機熔點測定儀（上海易測儀器設備有限公司）;CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司）;超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）;MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）;細胞培養(yǎng)瓶和96孔細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）;酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Thermo Fisher公司）;微量移液器（法國Gilson公司）。

1.2 藥品與試劑

鳶尾黃素（陜西綠清生物工程有限公司，批號：20160502，純度：98.86%）;乙醇胺、甲胺、乙胺、二甲胺、二乙胺、正丙胺（成都市科龍化工試劑廠，批號分別為：2015120401、2016010111、2016010201、2015120304、2016020301、2015080513，含量：均>98%）;甲醛溶液（成都金山化學試劑有限公司，批號：20160316，含量：37%～40%）;高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gbico公司，批號分別為：1645800、F160126）;MTT、二甲基亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰蛋白酶（美國Sigma公司，批號分別為：S16520、071M7014V、67874TT、BCBQ8161V）。

1.3 細胞與動物

人結腸癌細胞株HCT116、人肺癌細胞株A549、人肝癌細胞株HepG2均購自中國科學院細胞保存庫。小鼠，18～22 g，♀♂各半，由四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2018-19，飼養(yǎng)于四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SCXK（川）2018-100。

2 方法與結果

2.1 鳶尾黃素曼尼希堿衍生物的合成

取9.0 g鳶尾黃素（30 mmol），加入無水乙醇50 mL，水浴加熱溶解，再加入3.0 mL 37%的甲醛溶液（40 mmol）和不同的胺類試劑40 mmol，混勻，水浴回流3 h，取出放冷，冰箱放置過夜，析出沉淀，G3垂熔玻砂漏斗過濾，無水乙醇洗滌，60 ℃減壓干燥，即得淡黃色粗品。將粗品用80～100目硅膠拌樣后裝入硅膠色譜柱中，先后用不同比例的氯仿-甲醇（9 ∶ 1、6 ∶ 1、3 ∶ 1、1 ∶ 1，V/V）梯度洗脫，分段收集，根據(jù)薄層色譜（TLC）檢測結果，合并相同流分，回收溶劑，重結晶，過濾，減壓干燥，得到合成產物。當胺類試劑分別為乙醇胺、甲胺、二乙胺、二甲胺、乙胺、正丙胺時，合成產物分別為化合物1（3.56 g，收率31.7%）、化合物2（3.78 g，收率36.6%）、化合物3（3.65 g，收率31.3%）、化合物4（3.46 g，收率32.2%）、化合物5（4.59 g，收率42.7%）、化合物6（3.97 g，收率35.6%）。

2.2 化合物的結構鑒定

肉眼觀察鳶尾黃素和化合物1～6的顏色和形狀，采用WRS-2型微機熔點測定儀測定其熔點，UV測定采用UV-2401PC型紫外分光光度儀測定其最大紫外波長（λmax），F(xiàn)TIR8300型紅外檢測儀測定其紅外最大頻率 （νmax），采用RLC-6410型液質聯(lián)用儀分析其電噴霧質譜（ESI-MS）數(shù)據(jù)，采用AVⅡ型NMR儀分析其氫譜碳譜（1H-NMR;13C-NMR）。結果如下：

2.2.1 鳶尾黃素 淺黃色針晶（EtOH）;熔點：214～216 ℃;紫外的λmax：266 nm;紅外的νmax：3 410，1 160， ? ? 1 520，1 480，1 250，1 050 cm-1;ESI-MS（m/z）：301 [M+H]+;1H-NMR（DMSO，600 MHz） δ：13.09（1H，s，5-OH），10.77（1H，s，7-OH），9.58（1H，s，4′-OH），8.34（1H，s，H-2），7.37（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，H-6′），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，H-5′），6.44（1H，s，H-8），3.74（3H，s，OCH3）;13C-NMR（DMSO，600 MHz） δ：180.2（C-4），157.7（C-4′），157.3（C-7），154.0（C-2），153.4（C-9），152.7（C-5），131.3（C-6），130.5（C-2′，6′），121.6（C-1′），121.1（C-3），115.4（C-3′，5′），104.4（C-10），93.8（C-8），59.7（OCH3）;上述理化性質和光譜數(shù)據(jù)與文獻[2]中報道的一致，確定為鳶尾黃素。

2.2.2 化合物1 淡黃色細沙狀晶（EtOH）;熔點：189～191 ℃;紫外的λmax 273 nm;紅外的νmax：3 345，1 654， ? ? ?1 514，1 452，1 230，1 059 cm-1; ESI-MS（m/z）：374 [M+H]+;1H-NMR（DMSO，600 MHz） δ：13.08（1H，s，5-OH），8.06（1H，s，H-2），7.34（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，H-6′），6.81（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，H-5′），4.11（2H，s，CH2NHCH2CH2OH），3.66（3H，s，OCH3），3.64（2H，t，CH2NHCH2CH2OH），2.93（2H，t，CH2NHCH2CH2OH）; 13C-NMR（DMSO，600 MHz） δ：179.0（C-4），169.7（C-4′），157.6（C-7），152.6（C-9），152.3（C-2），151.7（C-5），133.7（C-6），130.6（C-2′，6′），122.7（C-1′），121.6（C-3），115.4（C-3′，5′），100.0（C-10），97.9（C-8），59.3（OCH3），57.7（CH2NHCH2CH2OH），48.9（CH2NHCH2CH2OH），43.0（CH2NHCH2CH2OH）;根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物為8-（N-羥乙基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮。

2.2.3 化合物2 淡黃色結晶性粉末（EtOH）;熔點：187～189 ℃;紫外的λmax：273 nm;紅外的νmax：3 341， ? ? ?1 628，1 504，1 227，1 028 cm-1; ESI-MS（m/z）：344[M+H]+;1H-NMR（DMSO，600 MHz） δ：13.14（1H，s，5-OH），8.24（1H，s，H-2），7.36（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，H-6′），6.64（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，H-5′），3.97（2H，s，CH2NHCH3），3.68（3H，s，OCH3），3.26（3H，s，CH2NHCH3）;13C-NMR（DMSO，600 MHz） δ：181.7（C-4），162.2（C-4′），154.3（C-7），152.2（C-9），151.2（C-2），150.7（C-5），132.9（C-6），130.2（C-2′，6′），124.5（C-1′），122.8（C-3），116.3（C-3′，5′），103.7（C-10），98.4（C-8），60.8（OCH3），45.6（CH2NHCH3），36.2（CH2NHCH3）;根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物為8-（N-甲基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮。

2.2.4 化合物3 淡黃色沙狀晶（EtOH）;熔點：190～192 ℃;紫外的λmax：273 nm;紅外的νmax：3 372，1 653， ? ? ?1 516，1 452，1 232，1 168，1 099，1 018 cm-1; ESI-MS （m/z）：386 [M+H]+;1H-NMR（DMSO，600 MHz） δ：13.04（1H，s，5-OH），8.21（1H，s，H-2），7.36（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，H-6′），6.82（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，H-5′），4.08 [2H，s，CH2N（CH2CH3）2]，3.71（3H，s，OCH3），2.85[4H， q，CH2N（CH2CH3）2]，1.16[6H，t，CH2N（CH2CH3）2];13C-NMR（DMSO，600 MHz） δ：182.6（C-4），165.1（C-4′），157.7（C-7），152.9（C-9），152.8（C-2），151.5（C-5），132.6（C-6），130.7（C-2′，6′），122.8（C-1′），122.0（C-3），115.5（C-3′，5′），102.4（C-10），98.1（C-8），59.7（OCH3），49.0[CH2N（CH2CH3）2]，46.3[CH2N（CH2CH3）2]，10.5[CH2N（CH2CH3）2];根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物為8-（N，N-二乙基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮。

2.2.5 化合物4 淡黃色沙狀晶（EtOH）;熔點：189～191 ℃;紫外的λmax：273 nm;紅外的νmax：3 364，1 635， ? ? 1 527，1 456，1 212，1 148 cm-1; ESI-MS; ESI-MS（m/z）：358[M+H]+;1H-NMR（DMSO，600 MHz） δ：12.87（1H， ?s，5-OH），8.34（1H，s，H-2），7.25（2H，d，J=8.5 Hz，H- ? 2′，H-6′），6.63（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，H-5′），3.86 ? ? [2H，s，CH2N（CH3）2]，3.73（3H，s，OCH3），2.14[6H，s， ? ? ? CH2N（CH3）2];13C-NMR（DMSO，600 MHz） δ：181.2（C-4），161.2（C-4′），154.7（C-7），152.6（C-9），152.1（C-2），151.3（C-5），132.2（C-6），130.5（C-2′，6′），124.7（C-1′），123.2（C-3），115.8（C-3′，5′），103.2（C-10）， ? ?98.8（C-8），60.8（OCH3），52.3[CH2N（CH3）2]，42.8 ? ? ? ? ? [CH2N（CH3）2];根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物為8-（N，N-二甲基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮。

2.2.6 化合物5 淡黃色結晶性粉末（EtOH）;熔點：189～191 ℃;紫外的λmax：273 nm;紅外的νmax：3 368， ? ? ?1 654，15 50，1 514，1 456，1 233，1 059，1 022 cm-1; ESI-MS（m/z）：358 [M+H]+;1H-NMR（DMSO，600 MHz） δ：11.69（1H，s，5-OH），8.23（1H，s，H-2），7.46（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，H-6′），7.19（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，H-5′），4.81（2H，s，CH2NHCH2CH3），4.25（3H，s，OCH3），3.57（2H，q，CH2NHCH2CH3），1.73（3H，t，CH2NHCH2CH3）;13C-NMR（DMSO，600 MHz） δ：182.6（C-4），156.3（C-4′），154.9（C-7），154.6（C-9），153.8（C-2），152.8（C-5），130.9（C-6），130.3（C-2′，6′），124.6（C-1′），122.4（C-3），115.8（C-3′，5′），105.8（C-10），98.5（C-8），60.9（OCH3），44.0（CH2NHCH2CH3），40.0（CH2NHCH2CH3），9.65（CH2NHCH2CH3）;根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物為8-（N-乙基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮。

2.2.7 化合物6 淡黃色結晶性粉末（EtOH）;熔點：188～190 ℃;紫外的λmax：273 nm;紅外的νmax：3 375， ? ? ?1 658，1 438，1 222，1 149，1 045 cm-1; ESI-MS（m/z）：372 [M+H]+;1H-NMR（DMSO，600 MHz） δ：12.98（1H，s，5-OH），8.17（1H，s，H-2），7.32（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，H-6′），6.74（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，H-5′），3.87（2H，s，CH2NHCH2CH2CH3），3.72（3H，s，OCH3），2.53（2H，t，CH2NHCH2CH2CH3），1.46（2H，m，CH2NHCH2CH2CH3），0.87（3H，t，CH2NHCH2CH2CH3）;13C-NMR（DMSO，600 MHz） δ：181.4（C-4），162.2（C-4′），154.3（C-7），151.7（C-9），151.1（C-2），150.7（C-5），133.2（C-6），130.9（C-2′，6′），123.4（C-1′），122.6（C-3），115.8（C-3′，5′），102.3（C- 10），99.8（C-8），60.8（OCH3），51.3（CH2NHCH2CH2CH3），44.6（CH2NHCH2CH2CH3），23.6（CH2NHCH2CH2CH3），11.3（CH2NHCH2CH2CH3）;根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物為8-（N-正丙基）-亞甲基胺基-5，7，4′-三羥基-6-甲氧基異黃酮。

2.3 鳶尾黃素和化合物1～6的溶解度考察

按照2015年版《中國藥典》一部凡例21的溶解度試驗方法[1]考察鳶尾黃素和化合物1～6的溶解度。稱取研成細粉的7個化合物，置于（25±2） ℃的適量水中，每隔5 min強力振搖30 s，觀察30 min內的溶解情況，并根據(jù)《中國藥典》中對各種溶解性能的定義進行判斷。鳶尾黃素和化合物1～6的溶解度測定結果見表1。

由表1可知，與鳶尾黃素比較，鳶尾黃素衍生物化合物1～6的溶解度明顯提高，其中化合物1的溶解度最大，達到6.2 mmol/L，是鳶尾黃素的20倍。

2.4 鳶尾黃素和化合物1～6對HCT116、A549、HepG2細胞體外增殖的影響

2.4.1 細胞培養(yǎng) 分別取HCT116、A549、HepG2細胞以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100 u/mL，鏈霉素100 μg/mL）培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內，每隔2～3 d，以0.05%胰蛋白酶-0.53 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代。

2.4.2 分組與給藥 分別取對數(shù)生長期的HCT116、A549、HepG2細胞，用胰酶消化，吹散，制備細胞混懸液，調整細胞密度，按6×103個/孔接種到96孔板中，在37 ℃下培養(yǎng)過夜。試驗分為化合物1～6組（分別加入化合物1～6溶液至終濃度為2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L）、空白對照組（只加培養(yǎng)基）和鳶尾黃素組（陽性對照，加入鳶尾黃素溶液終濃度為2.5、5、10、20、40、80、160 ? ? ? ?μmol/L），每個濃度做3個重復，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

2.4.3 檢測方法 采用MTT比色法[21-22]，在培養(yǎng)時間結束前4 h，將96孔板里的培養(yǎng)液吸出，加入100 μL磷酸鹽緩沖液和10 μL 5 mg/mL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，再加入100 μL 10%十二烷基磺酸鈉溶液，37 ℃孵育過夜。使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570 nm波長處的光密度（OD），計算抑制率，抑制率（%）=（空白對照組OD值-藥物組OD值）/空白對照組OD值×100%，采用Curve Expert軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。鳶尾黃素和化合物1～6對3種癌細胞株IC50的測定結果見表2。

由表2可知，鳶尾黃素衍生物化合物1、3、5對HCT116、A549、HepG2細胞的IC50均低于鳶尾黃素，其中化合物3對HCT116、HepG2細胞的IC50均<20 μmol/L。

2.5 鳶尾黃素和化合物1～6對H22肝癌荷瘤小鼠的抑制作用研究

2.5.1 樣品溶液的制備 將鳶尾黃素和化合物1～6，分別用溶劑（70%生理鹽水、25%DMSO、5%聚山梨酯80混合溶液）溶解，配制成10 mg/mL混懸液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 分組、給藥與檢測 參考文獻[23]的方法，取小鼠腹腔接種7 d的H22細胞，配制成1×107 mL-1單細胞混懸液，在無菌條件下接種于小鼠右側腋下，每只2×106個細胞。接種第2天，將小鼠隨機分為空白對照組、鳶尾黃素組（陽性對照）和化合物1～6組，每組10只。分組當天腹腔注射相應樣品溶液0.1 mL/10 g，給藥劑量均為100 mg/kg（根據(jù)急性毒性和體外抑制率推算），空白對照組小鼠注射未加藥物的溶劑，每天給藥1次，連續(xù)2周后，脫頸處死小鼠，剝離瘤塊稱質量，計算抑瘤率，抑瘤率（%）=（空白對照組瘤質量-藥物組瘤質量）/空白對照組瘤質量×100%。鳶尾黃素和化合物1～6對H22肝癌荷瘤小鼠抑瘤率的測定結果見表3。

由表3可知，鳶尾黃素衍生物化合物1、3、5對H22荷瘤小鼠的抑瘤率均高于鳶尾黃素，其中化合物3的抑瘤率最高，達到57.20%，相對于鳶尾黃素提高了73.07%。

3 討論

曼尼希反應條件溫和，所得產品易純化，收率較高，制備步驟簡單。本試驗利用鳶尾黃素A環(huán)C-8位活潑H與脂肪胺和甲醛溶液進行曼尼希反應，共合成了6個曼尼希堿衍生物，其結構經(jīng)紅外、紫外、MS、NMR等數(shù)據(jù)確證。比較鳶尾黃素和化合物1～6的NMR譜發(fā)現(xiàn)，化合物1～6的δ 3.86～4.81左右均出現(xiàn)了CH2的單峰，即為曼尼希堿中與胺相連的亞甲基峰;而相對于鳶尾黃素δ 6.44出現(xiàn)的8位H峰，化合物1～6均消失，且C-8向低場移動，這些光譜數(shù)據(jù)均表明鳶尾黃素的A環(huán)C-8位上發(fā)生取代，生成了新的衍生物。

本研究通過體內、體外試驗考察了鳶尾黃素衍生物化合物1～6的抗腫瘤活性，結果表明，化合物1、3、5均具有強于鳶尾黃素的抗腫瘤活性，特別是化合物3的抗腫瘤活性最強，可作為潛在抗腫瘤化合物繼續(xù)研發(fā)。本研究結果也為進一步研究鳶尾黃素的結構修飾及其構效關系打下了基礎，筆者下一步將嘗試引入更多種胺類化合物進行結構修飾，期待得到具有顯著抗腫瘤活性的鳶尾黃素曼尼希堿衍生物。

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（收稿日期：2019-07-30 修回日期：2019-09-08）

（編輯：鄒麗娟）