馬天成 孫宇 馬玉坤 劉雷 孫珈 郭麗娜 劉琦

中圖分類號 R917 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2796-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.12

摘 要 目的：分析巖大戟內(nèi)酯B在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，預(yù)測其代謝途徑。方法：將大鼠隨機分為空白組（灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）和給藥組（灌胃巖大戟內(nèi)酯B，100 mg/kg），每組8只。分別收集給藥后0～12、>12～24、>24～36 h的糞便，給藥后0～2、>2～8、>8～12、>12～24、>24～36、>36～48 h的尿液以及給藥后1、2、8、12、24、36 h的血液樣品，分別以超聲提取法、固相萃取法、蛋白沉淀法處理后，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）聯(lián)用技術(shù)和Analyst? TF 1.7.1、PeakView? 2.2等軟件聯(lián)合分析、鑒定各樣品中的代謝產(chǎn)物。結(jié)果與結(jié)論：從大鼠糞便中共檢測到原型藥物和7個代謝產(chǎn)物，從尿液和血液樣品中分別檢測到1、2個代謝產(chǎn)物。巖大戟內(nèi)酯B灌胃后在大鼠體內(nèi)經(jīng)Ⅰ相的開環(huán)、脫水、氧化、脫氧、加氫反應(yīng)等途徑代謝;未檢測到Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞 巖大戟內(nèi)酯B;超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);代謝產(chǎn)物;鑒定;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To analyze the metabolites of jolkinolide B in rats， and predict its metabolism pathway. METHODS： The rats were randomly divided into blank group （0.5% CMC-Na， ig） and administration group （jolkinolide B， ig， 100 mg/kg）， with 8 rats in each group. The fecal samples were collected at >0-12， >12-24， >24-36 hours after administration; the urine samples were collected at >0-2， >2-8， >8-12， >12-24， >24-36， >36-48 hours after administration; the blood samples were collected at 1， 2， 8， 12， 24， 36 hours after administration. UPLC-Q-TOF/MS combined with Analyst? TF 1.7.1 and PeakView? 2.2 software were used to analyze and identify the metabolites in the samples after treated with ultrasonic extraction， solid phase extraction and protein precipitation. RESULTS & CONCLUSIONS： Prototype drugs and seven metabolites were detected in rat’s fecal samples， and one or two metabolites were detected in urine and blood samples， respectively. After intragastric administration， the metabolism of jolkinolide B in rats is mainly through ring opening， oxidation， dehydration， deoxygenation and hydrogenation of phase Ⅰ， but no phase Ⅱ metabolites were detected.

KEYWORDS? ?Jolkinolide B; UPLC-Q-TOF/MS; Metabolites; Identification; Rats

狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud.）主要生長于我國內(nèi)蒙古、東北及河北等地區(qū);其根入藥為中藥狼毒，是我國傳統(tǒng)中藥材。該藥味苦、辛，性平，有毒，具有泄水逐飲、破積殺蟲的功效，主治水腫腹脹、痰食蟲積、心腹疼痛、結(jié)核、疥癬等癥[1]。狼毒大戟的主要化學(xué)成分為脂溶性二萜類成分[2-3]，其中巖大戟內(nèi)酯B為其指標(biāo)性成分，分子式為C20H26O4，具有抗腫瘤、抗病毒、抑菌等多種活性[4-9]。

天然藥物成分經(jīng)口服后，在體內(nèi)以原型形式存在的較少，大多數(shù)成分在吸收過程中會受到胃腸道酸堿環(huán)境、腸道微生物及肝藥酶的影響，發(fā)生一系列代謝反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成新的物質(zhì)。由此可見，藥物在體內(nèi)真正發(fā)揮藥效作用的既有可能是原型成分，也有可能是該成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化后形成的代謝產(chǎn)物。因此，對藥物代謝進行研究將有助于了解其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程，可為確定其在體內(nèi)的代謝規(guī)律、代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及作用機制提供科學(xué)依據(jù)[10]。飛行時間質(zhì)譜（TOF-MS）可進行高分辨率質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，并可提供精確的相對分子質(zhì)量以及裂解信息，可為中藥化學(xué)成分的體內(nèi)代謝研究提供可靠、有效的技術(shù)保障[11-12]。鑒于巖大戟內(nèi)酯B的藥用價值，本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）聯(lián)用技術(shù)，系統(tǒng)分析了該化合物在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，并對其代謝途徑進行預(yù)測，旨在為其今后的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

30A型UPLC儀（日本Shimadzu公司）;Triple TOF 4600型質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）;AB135-S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;Centrifuge 5417R型離心機（德國Eppendorf公司）;Elix Essential 5 UV型純水儀（德國Merck Millipore公司）;B8800型超聲波清洗器（美國Branson公司）;HYQ-2121A型渦旋混勻器（美國Crystal公司）;MTN-2800D型氮吹濃縮裝置（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

巖大戟內(nèi)酯B、巖大戟內(nèi)酯A對照品均由本實驗室制備（經(jīng)高效液相色譜法檢測，純度均大于98%）;甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動物

清潔級健康SD大鼠，雄性，4～5周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（遼）2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 巖大戟內(nèi)酯B混懸液的制備

精密稱取巖大戟內(nèi)酯B對照品300 mg，加0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液30 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的混懸液，備用。

2.2 分組與給藥

所有SD大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白組和給藥組，每組各8只。禁食、不禁水12 h后，給藥組大鼠單次灌胃“2.1”項下巖大戟內(nèi)酯B混懸液（100 mg/kg，劑量參照本課題組前期預(yù)實驗結(jié)果確定），空白組大鼠單次灌胃等體積0.5% CMC-Na溶液。

2.3 樣品采集與處理

2.3.1 糞便和尿液 隨機選取空白組和給藥組大鼠各4只，分別收集其給藥后0～12、>12～24、>24～36 h的糞便以及給藥后0～2、>2～8、>8～12、>12～24、>24～36、>36～48 h的尿液，分別混合后于-20 ℃下凍存，備用。

糞便樣品采用超聲提取法處理。將干燥后的糞便樣品研磨均勻，稱取1.0 g，加甲醇20 mL超聲（功率：280 W，頻率：40 kHz）處理30 min，然后以3 500 r/min離心10 min;取上清液200 μL，在37 ℃下以氮氣流吹干;殘渣加乙腈200 μL復(fù)溶，渦旋30 s，以14 000 r/min離心10 min，取上清液1 μL，進行UPLC-Q-TOF/MS分析。

尿液樣品采用固相萃取法處理。將尿液樣品于室溫下解凍，量取200 μL，以3 500 r/min離心10 min;取上清液100 μL，經(jīng)活化的Bond Elut C18 cartridges固相萃取柱（填料量：500 mg，柱容量：3 mL;依次用甲醇2 mL、水2 mL反復(fù)洗脫3次以活化），依次用水2 mL、甲醇2 mL洗脫，收集甲醇洗脫液，用氮氣流吹干;殘渣加甲醇100 μL復(fù)溶，渦旋30 s，以14 000 r/min離心10 min，取上清液3 μL，進行UPLC-Q-TOF/MS分析。

2.3.2 血漿 選取空白組和給藥組余下的大鼠各4只，分別于給藥后1、2、8、12、24、36 h自眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，置于涂有肝素的離心管中，以3 000 r/min離心10 min，分離血漿，混合后于-20 ℃凍存，備用。

血漿樣品采用蛋白沉淀法處理。取血漿樣品200 μL，加甲醇800 μL，渦旋30 s，以16 000 r/min離心10 min;取上清液，于37 ℃下以氮氣流吹干;殘渣加乙腈200 μL復(fù)溶，渦旋30 s，以14 000 r/min離心10 min，取上清液3 μL，進行UPLC-Q-TOF/MS分析。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相：水（含0.1%甲酸，A相）-乙腈（含0.1%甲酸，B相），梯度洗脫（0～0.01 min，20%B;0.01～1 min，20%B→30%B;1～7 min，30%B→50%B;7～10 min，50%B→70%B;10～15 min，70%B→100%B;15～16 min，100%B;16～16.1 min，100%B→20%B;16.1～18 min，20%B）;柱溫：40 ℃;流速：0.3 mL/min;進樣量：3 μL（尿液、血液）或 1 μL（糞便）。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）;離子噴霧電壓：5.5 kV;離子源溫度：600 ℃;去簇電壓（DP）：100 V;碰撞能（CE）：10 eV。霧化氣、輔助氣和氣簾氣：氮氣;霧化氣壓力：55 psi;輔助氣壓力：55 psi;氣簾氣壓力：35 psi。掃描模式：正離子;掃描范圍：100～1 200 amu全掃描;累積掃描時間：250 ms。采用數(shù)據(jù)依賴采集（IDA）模式進行分析，即對每個分析物中質(zhì)譜響應(yīng)超過100 cps的15個碎片離子進行子離子掃描，掃描范圍為100～1 200 amu，累積掃描時間為100 ms。采用自動校準(zhǔn)系統(tǒng)（CDS）對質(zhì)譜進行自動調(diào)諧和校正。

2.5 巖大戟內(nèi)酯B的質(zhì)譜裂解途徑分析

稱取巖大戟內(nèi)酯B對照品適量，加入適量0.5%CMC-Na溶液，制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的對照品溶液。取上述對照品溶液1 μL，按“2.4”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，巖大戟內(nèi)酯B的保留時間（tR）約為11.8 min，其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z 331.190 1。其碎片離子峰中，m/z 313.180 0、295.169 3推測是由準(zhǔn)分子離子依次脫去1分子H2O而得;m/z 303.195 9、285.185 0、267.174 6推測是由準(zhǔn)分子離子依次脫去1分子CO和2分子H2O而得;m/z 193.050 1、165.055 2、137.060 1、125.023 5為巖大戟內(nèi)酯B裂環(huán)后產(chǎn)生的離子碎片。該化合物可能的裂解途徑見圖2。由于大多數(shù)代謝產(chǎn)物仍會保留原型的基本骨架或母核結(jié)構(gòu)，因此以上對巖大戟內(nèi)酯B的質(zhì)譜裂解規(guī)律可作為其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定的重要參考依據(jù)。

2.6 巖大戟內(nèi)酯B在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析鑒定

取“2.3”項下糞便、尿液、血液預(yù)處理后樣品各適量，按“2.4”項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析。采用Analyst?TF 1.7.1和PeakView?2.2軟件采集并處理數(shù)據(jù)，采用MetabolitePilot 1.5和MasterView 1.1軟件對代謝產(chǎn)物進行預(yù)測與鑒定，采用MultiQuant 3.0.2軟件對各代謝產(chǎn)物的峰面積進行積分，各組大鼠各樣品的提取離子流圖見圖3～圖5。結(jié)果，從糞便樣品中共檢測到8個化合物，包括原型（M0）和7個代謝產(chǎn)物（M1～M7）;從尿液樣品中共檢測到1個代謝產(chǎn)物（M6）;從血液樣品中共檢測到2個代謝產(chǎn)物（M1、M5），代謝產(chǎn)物的二級質(zhì)譜圖見圖6，其代謝分析結(jié)果見表1。

由上述結(jié)果可見，M0的分子式為C20H26O4，tR為11.82 min，[M+H]+為m/z 331.190 9，通過比對相應(yīng)對照品，確定M0為巖大戟內(nèi)酯B原型。

M1的分子式為C20H30O4，tR為8.16 min，[M+H]+為m/z 335.221 3，分子量約比M0多4。由于巖大戟內(nèi)酯B原型中存在2個三元氧環(huán)，推測在體內(nèi)可能發(fā)生了氧環(huán)開裂。二級質(zhì)譜圖中，碎片離子m/z 317.212 0、299.200 1、281.198 0為m/z 335.221 3依次脫去1分子H2O而得，m/z 271.204 1為m/z 299.200 1進一步脫去CO而得，m/z 189.125 1為M1開環(huán)而產(chǎn)生的碎片離子。由此推測，M1為M0中2個氧環(huán)開裂而形成的代謝產(chǎn)物。

M2的分子式為C20H26O6，tR為10.80 min，[M+H]+為m/z 363.216 7，分子量約比M0多32，推測可能發(fā)生了氧化反應(yīng)。二級質(zhì)譜圖中，碎片離子m/z 345.204 3、331.188 8、313.179 6為m/z 363.216 7依次脫去1分子H2O而得，m/z 285.182 4為m/z 313.179 6進一步脫去CO而得，m/z 207.065 1等為M2開環(huán)而產(chǎn)生的碎片離子。由此推測，M2為二羥基巖大戟內(nèi)酯B，為M0的氧化產(chǎn)物。

M3的分子式為C20H28O3，tR為11.52 min，[M+H]+為m/z 317.211 8，分子量約比M0少14，推測可能發(fā)生了脫氧再加氫的反應(yīng)。二級質(zhì)譜圖中，碎片離子m/z 299.200 4為m/z 317.210 0脫去1分子H2O而得，m/z 271.203 2為m/z 299.200 4進一步脫去CO而得，m/z 179.069 2、133.064 6等為M3開環(huán)而產(chǎn)生的碎片離子。由此推測，M3為巖大戟內(nèi)酯B脫氧加氫的產(chǎn)物。

M4的分子式為C20H26O3，tR為12.84 min，[M+H]+為m/z 315.195 5，分子量約比M0少16，推測其可能發(fā)生了氧環(huán)開環(huán)后 的脫水反應(yīng)。通過比對相應(yīng)對照品，鑒定M4為巖大戟內(nèi)酯A，為M0的開環(huán)脫水代謝產(chǎn)物。

M5的分子式為C20H28O2，tR為13.93 min，[M+H]+為m/z 301.215 9，分子量約比M3少16，推測可能發(fā)生了脫氧反應(yīng)。二級質(zhì)譜圖中，碎片離子m/z 283.206 8為m/z 301.215 9脫去1分子H2O而得，m/z 255.208 3則為m/z 283.206 8進一步脫去CO而得;m/z 231.135 1、217.123 3則為A環(huán)裂解所產(chǎn)生的碎片離子，m/z 199.150 8、173.131 7為脫酯及環(huán)裂解所產(chǎn)生的碎片離子。由此推測，M5為M3的脫氧產(chǎn)物。

M6的分子式為C20H32O2，tR為14.52 min，[M+H]+為m/z 305.248 3，分子量約比M5多4，推測可能發(fā)生了加氫反應(yīng)。二級質(zhì)譜圖中，碎片離子m/z 287.236 4、269.221 7為m/z 305.248 3依次脫去1分子H2O而得，m/z 259.206 3為m/z 287.236 4進一步脫去CO而得;m/z 235.168 8、221.157 3為A環(huán)裂解而產(chǎn)生的碎片離子，m/z 203.181 2為脫酯及環(huán)裂解產(chǎn)生的碎片離子。由此推測，M6為M5的加氫產(chǎn)物。

M7的分子式為C20H26O2，tR為14.74 min，[M+H]+為m/z 299.200 9，分子量約比M0少36，推測可能發(fā)生了脫水反應(yīng)。二級質(zhì)譜圖中，碎片離子m/z 215.105 9、201.089 9為A環(huán)裂解而得，m/z 175.075 7、161.059 5為B環(huán)裂解而得。由此推測，M7為M1的脫水產(chǎn)物。

2.7 巖大戟內(nèi)酯B代謝途徑預(yù)測

從大鼠糞便、尿液、血液樣品中共鑒定得到了7個代謝產(chǎn)物，且主要集中在糞便樣品中。經(jīng)分析，Ⅰ相代謝產(chǎn)物較多，主要經(jīng)氧化、脫氧、加氫、開環(huán)等反應(yīng)而得;未發(fā)現(xiàn)Ⅱ相代謝產(chǎn)物。其主要代謝途徑見圖7。

3 討論

在預(yù)實驗中，筆者同時采用了正、負(fù)離子兩種質(zhì)譜掃描模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正離子掃描模式可獲得更好的二級碎片，故最終采用正離子模式對代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行解析。此外，筆者還考察了流動相體系（甲醇-水、乙腈-水以及在上述流動相體系兩相中均添加適量甲酸）對色譜分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）作為流動相時分離效果較好。

本研究在優(yōu)化色譜與質(zhì)譜條件的基礎(chǔ)上，對巖大戟內(nèi)酯B在大鼠體內(nèi)的代謝情況進行了系統(tǒng)研究。結(jié)果，在糞便樣品中共檢出原型和7個代謝產(chǎn)物，在尿液和血液樣品中分別檢出1個和2個代謝產(chǎn)物，其原因可能為巖大戟內(nèi)酯B的極性偏小，經(jīng)胃腸道代謝后，隨糞便排出體外，而在尿液和血液中的含量較低，故難以被檢出[13]。代謝途徑預(yù)測結(jié)果顯示，巖大戟內(nèi)酯B在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生了氧化、脫氧、氧環(huán)開裂、加氫、脫水等Ⅰ相代謝反應(yīng)。通過數(shù)據(jù)解析可知，巖大戟內(nèi)酯B可通過氧化反應(yīng)生成產(chǎn)物M2，C7、C17位可能是其氧化位點[14-16];巖大戟內(nèi)酯B的三元氧環(huán)可發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，生成產(chǎn)物M1，隨后M1繼續(xù)脫水，生成產(chǎn)物M7;與此同時，巖大戟內(nèi)酯B亦可直接發(fā)生開環(huán)、脫水反應(yīng)，生成產(chǎn)物M4[15];此外，M4可依次通過加氫、脫氧、加氫等反應(yīng)生成產(chǎn)物M3、M5、M6。

巖大戟內(nèi)酯B是狼毒大戟的主要活性成分，具有較強的藥理活性，也是該藥材物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重點之一。本研究首次采用UPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)，根據(jù)巖大戟內(nèi)酯B的結(jié)構(gòu)及碎片離子特征，分析并鑒定出大鼠糞便、尿液和血液樣品中的7個Ⅰ相代謝產(chǎn)物。但由于二萜類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且質(zhì)譜對同分異構(gòu)體的鑒定具有一定的局限性，故有必要對其代謝產(chǎn)物進行分離純化，并借助核磁共振等手段對其具體結(jié)構(gòu)進行確證;此外，各時間段生物樣品代謝產(chǎn)物的差異也有待進一步分析。

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（收稿日期：2019-03-02 修回日期：2019-08-06）

（編輯：張元媛）