周慶　王巖　宋偉　陳婷　韓士群

摘要：通過高通量測(cè)序的方法，研究了漂浮植物在凈化藻華養(yǎng)殖廢水過程中對(duì)潛在病原菌和致病相關(guān)基因的影響。結(jié)果表明，漂浮植物鳳眼蓮能夠顯著降低藻華養(yǎng)殖廢水中潛在病原菌的總體水平，但是其中的弓形菌屬、螺桿菌屬、腸桿菌屬細(xì)菌水平在鳳眼蓮處理的12～18d內(nèi)出現(xiàn)短暫增長(zhǎng)，而密螺旋體屬和假單胞菌屬細(xì)菌水平在鳳眼蓮處理的30d時(shí)分別攀升至同期藻華養(yǎng)殖廢水對(duì)照的（6.2+3.5）倍和（44.6+20.9）倍。漂浮植物鳳眼蓮處理后，藻華養(yǎng)殖廢水中與人類代謝、傳染和免疫疾病相關(guān)的基因水平逐漸低于對(duì)照，但是與人類神經(jīng)疾病相關(guān)的基因水平與同期對(duì)照相比卻提升了36.77%+6.91%。可見，僅靠漂浮植物凈化處理不能完全消除養(yǎng)殖廢水排放病原菌的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)殖廢水;藻華;漂浮濕地;鳳眼蓮;潛在病原菌

中圖分類號(hào)：X592

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-4440（2019）02-0340-06

隨著中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、高密度化的發(fā)展，養(yǎng)殖廢水的排放量每年近3x108 m3[1]養(yǎng)殖廢水中大量未被魚類食用的飼料和魚類排出的糞便，使水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化問題日趨嚴(yán)重，促進(jìn)養(yǎng)殖廢水的凈化處理受到越來越多的關(guān)注。為了滿足高效、經(jīng)濟(jì)的要求，水生植物對(duì)養(yǎng)殖廢水的強(qiáng)化凈化成為養(yǎng)殖廢水凈化處理的重要措施之一。許多研究者發(fā)現(xiàn)，空心菜、金魚藻、鳳眼蓮、水花生、水蕹菜、苦草、伊樂藻和輪葉黑藻等具有較好的凈化養(yǎng)殖廢水的能力[25]。其中，以鳳眼蓮為代表的漂浮植物因其超強(qiáng)的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物去除能力被較為廣泛地應(yīng)用到漂浮濕地的構(gòu)建上川。但是，已有的研究多側(cè)重在水生植物對(duì)養(yǎng)殖廢水的氮、磷和化學(xué)需氧量的削減效果和對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體細(xì)菌多樣性的影響上。養(yǎng)殖廢水經(jīng)漂浮濕地水生植物凈化后的潛在病原菌特征以及致病相關(guān)基因方面的狀況卻鮮有報(bào)道。此外，養(yǎng)殖廢水中藻類容易大量繁殖，其中藍(lán)藻密度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，可以達(dá)到浮游藻類總密度的80%[12]。藍(lán)藻又名藍(lán)細(xì)菌，屬于細(xì)菌界，具有產(chǎn)毒素能力的藍(lán)細(xì)菌對(duì)水環(huán)境和人畜構(gòu)成了極大的致病危害，因此，潛在的產(chǎn)毒藍(lán)細(xì)菌特征成為水體潛在病原菌研究中不可缺少的一部分。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)在河流、湖泊和水庫等水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究中已得到廣泛應(yīng)用[13-5。本研究主要以鳳眼蓮構(gòu)建的漂浮濕地為研究對(duì)象，通過高通量測(cè)序的方法，分析鳳眼蓮在凈化藻華養(yǎng)殖廢水過程中水體潛在病原菌的變化，以及致病基因方面的差異，以期為養(yǎng)殖廢水的處理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

養(yǎng)殖廢水取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院養(yǎng)殖池。養(yǎng)殖池24m3，養(yǎng)殖鯉魚40kg，每天喂飼量1kg，每隔7d換水1次，已養(yǎng)殖42d。排放廢水的總氮、總磷質(zhì)量濃度分別為（13.83+0.42）mg/L和（5.89+0.54）mg/L，藻細(xì)胞密度為1L（5.42+0.86）x107個(gè)。

鳳眼蓮[Eichhornia crassipes（Mart）Solms]取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鳳眼蓮保種池，正值7月鳳眼蓮分蘗繁殖和生長(zhǎng)的旺盛階段，經(jīng)去除殘?bào)w，自來水沖洗，0.01%高錳酸鉀浸泡，去離子水充分沖洗后，選取大小基本一致，株高平均為42cm的健康植株，在濾紙過濾后的養(yǎng)殖廢水中預(yù)培養(yǎng)7d，再用于試驗(yàn)。培養(yǎng)條件：溫度28℃，相對(duì)濕度75%，光照度40μumol/（m2·s），光照周期12h：12h。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在12L平底敞口玻璃器皿中進(jìn)行，按16kg/m3的投放密度，在10L養(yǎng)殖廢水中加入初始鮮質(zhì)量約160g的鳳眼蓮行凈化處理，以不加鳳眼蓮作為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)條件同方法1.1。試驗(yàn)周期為30d，每6d采集水樣，用0.22 μum孔徑無菌濾膜過濾，將過濾后的濾膜放入-80℃冰箱暫存，用于后續(xù)DNA提取和高通量測(cè)序。

1.3 DNA提取與高通量測(cè)序

采用PowerWater? SterivexTM DNA Isolation Kit（美國(guó)MOBIO公司產(chǎn)品）提取基因組DNA，用分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA。將合格的DNA樣品送至上海派森諾生物科技有限公司，對(duì)16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序。PCR擴(kuò)增的引物序列為338F（5'-ACTC-CTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3'）。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3min;95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共27個(gè)循環(huán);最終72℃延伸5min。DNA測(cè)序文庫采用TruSeq? Nano DNA LT Sample Prep Kit（美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品）構(gòu)建，應(yīng)用MiSeq ReagentKit V3（600 cycles）進(jìn)行2x300 bp的雙端測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Qiime軟件平臺(tái)對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按序列相似度0.97進(jìn)行聚類，一個(gè)單元就是一個(gè)OTU。通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)獲得每個(gè)OTU代表序列的分類學(xué)信息[16]。根據(jù)OTU的分類學(xué)信息，綜合文獻(xiàn)[17]～[19]歸納的信息統(tǒng)計(jì)潛在病原菌。基于宏基因組物種豐度信息以及物種的基因組數(shù)據(jù)庫信息，利用軟件PICRUSt以及Greengenes和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能基因的預(yù)測(cè)和相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 漂浮植物鳳眼蓮對(duì)藻華養(yǎng)殖廢水潛在病原菌的影響

潛在病原菌的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，藻華養(yǎng)殖廢水中共有12個(gè)潛在病原菌屬，分別隸屬于微囊藻屬（Mi-crocystis）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、立克次氏體屬（Rickettsia）、弓形菌屬（Arcobacter）、螺桿菌屬（Helicobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、軍團(tuán)桿菌屬（Legionella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、密螺旋體屬（Treponema）、鉤端螺旋體屬（Leptospira）。其中，相對(duì)豐度最高的屬為微囊藻屬，占潛在病原菌總量的90.03%+0.47%;其次為分枝桿菌屬，占8.30%士0.37%。與對(duì)照相比，凈化處理12d時(shí)，鳳眼蓮處微囊藻屬細(xì)菌是養(yǎng)殖廢水中水華藍(lán)藻中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，也是釋放具有致肝癌作用的微囊藻毒素的潛在細(xì)菌。在漂浮植物鳳眼蓮影響下，養(yǎng)殖廢水中微囊藻屬病原菌水平加速減少并維持在較低水平，微囊藻屬病原菌衰亡后的再次復(fù)興也得到了有效抑制（圖2a）。水體鉤端螺旋體屬和立克次氏體屬病原菌受漂浮植物鳳眼蓮影響后加速消亡（圖2b、圖2c）。芽孢桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、軍團(tuán)桿菌屬和分枝桿菌屬病原菌的生長(zhǎng)受到了漂浮植物鳳眼蓮的抑制，30d時(shí)鳳眼蓮處理的病原菌水平顯著低于對(duì)照（圖2d～圖2g），但是其中的軍團(tuán)桿菌屬和分枝桿菌屬病原菌的水平經(jīng)過鳳眼蓮處理后，還是比初始水平顯著提升了。

還有一些潛在病原菌的生長(zhǎng)在一定程度上反而受到了鳳眼蓮的促進(jìn)。如圖3所示，弓形菌屬、腸桿菌屬和螺桿菌屬病原菌的水平在鳳眼蓮處理12～18d時(shí)均顯著高于對(duì)照，但30d后又與對(duì)照一樣恢復(fù)至初始水平。而密螺旋體屬和假單胞菌屬病原菌的水平，則在鳳眼蓮處理18d時(shí)顯著高于對(duì)照，并在30d時(shí)分別攀升至同期對(duì)照的（6.2+3.5）倍和（44.6+20.9）倍。

2.2 漂浮植物鳳眼蓮對(duì)藻華養(yǎng)殖廢水細(xì)菌群落中與人類疾病相關(guān)基因的影響

細(xì)菌群落功能基因的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，藻華養(yǎng)殖廢水中細(xì)菌有許多基因與人類代謝疾病、傳染疾病、免疫疾病和神經(jīng)疾病關(guān)聯(lián)。漂浮植物鳳眼蓮處理藻華養(yǎng)殖廢水過程中，處理6d時(shí)水體細(xì)菌群落中與人類代謝疾病相關(guān)的基因水平顯著低于對(duì)照，處理6～24d時(shí)水體中與人類傳染疾病相關(guān)的基因水平顯著低于對(duì)照，處理18d以后水體細(xì)菌群落中與人類免疫疾病相關(guān)的基因水平也顯著低于對(duì)照，但是處理24d后水體中與人類神經(jīng)疾病相關(guān)的基因水平卻顯著高于對(duì)照（圖4）。

3 討論

中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)成為舉足輕重的產(chǎn)業(yè)，并在全世界的養(yǎng)殖業(yè)中占有巨大的份額。但是，目前中國(guó)的養(yǎng)殖廢水多伴有藍(lán)藻水華，且養(yǎng)殖廢水排放的標(biāo)準(zhǔn)主要由氮、磷等這類基本理化指標(biāo)組成。水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水經(jīng)處理以后，雖然一部分被養(yǎng)殖循環(huán)利用，但大部分最終要排放進(jìn)入自然水體。漂浮植物鳳眼蓮去除水體中營(yíng)養(yǎng)鹽的能力已經(jīng)得到公認(rèn)”，但是理化指標(biāo)達(dá)標(biāo)排放的養(yǎng)殖水體存在的對(duì)人類有害的病原菌風(fēng)險(xiǎn)值得探究。

Blumenthal等[21]和Stewart等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在炎熱的天氣下，用傳統(tǒng)的大腸桿菌或大腸菌群指標(biāo)來指示病原菌的存在和水平是不充分的。鳳眼蓮等水生植物存在能夠促進(jìn)自身生長(zhǎng)的腸桿菌屬內(nèi)生菌[23]，容易干擾傳統(tǒng)的指示病原菌存在和水平的大腸桿菌或大腸菌群方法。此外，許多病原菌可以進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC）[24），傳統(tǒng)的培養(yǎng)法低估了這部分病原菌，但是它們依然具有感染的特性[25]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過高通量測(cè)序獲得的大量序列信息，將更全面地反映病原菌的變化[26]。

本研究通過16SrRNA基因高變區(qū)的高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，漂浮植物鳳眼蓮能夠顯著降低藻華養(yǎng)殖廢水中潛在病原菌的總體水平，但是對(duì)于不同的潛在病原菌的影響有差異，原因可能是鳳眼蓮的根系及其分泌物為部分微生物提供了適宜的棲息地和避難所[27]。弓形菌屬、螺桿菌屬、腸桿菌屬、密螺體屬和假單胞菌屬細(xì)菌雖然在鳳眼蓮處理的不同階段出現(xiàn)交替增長(zhǎng)，但可能由于他們的相對(duì)豐度以及相關(guān)疾病基因的拷貝數(shù)較小，并沒有引起水體細(xì)菌群落中與人類代謝、免疫、傳染疾病相關(guān)的基因水平的提升。然而，水體細(xì)菌群落中與人類神經(jīng)疾病相關(guān)的基因水平受鳳眼蓮影響卻顯著提升了，鳳眼蓮處理30d時(shí)與同期對(duì)照相比提升了36.77%+6.91%，這一提升的風(fēng)險(xiǎn)還有待深入研究。

假單胞菌屬細(xì)菌是水生態(tài)環(huán)境中普遍存在的具有生物修復(fù)功能的微生物[28]，但許多假單胞菌卻是病原菌[29]。應(yīng)用漂浮植物凈化藻華養(yǎng)殖尾水過程中，假單胞菌屬細(xì)菌水平的提升有利于植物與微生物對(duì)水環(huán)境的協(xié)同修復(fù)，有利于水體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的去除，但是水生植物并沒有選擇病原菌與非病原菌的能力。

因此，雖然漂浮植物鳳眼蓮能有效降低藻華養(yǎng)殖廢水中潛在病原菌的總體水平，但僅用這一個(gè)步驟，可能還不能完全消除病原菌的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步配合使用臭氧[30]、納米抗菌材料[31]或者生物沙濾[32]的方法可能有助于將這一風(fēng)險(xiǎn)降到最低。本研究通過室內(nèi)靜態(tài)模擬試驗(yàn)初步探討了漂浮植物鳳眼蓮處理藻華養(yǎng)殖廢水對(duì)人類健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)，但是室內(nèi)靜態(tài)模擬試驗(yàn)存在一定的局限性，沒有涉及流動(dòng)水體以及底泥微生態(tài)的影響，與漂浮濕地原位環(huán)境相比具有一定的差異性，因此后續(xù)還需要在漂浮濕地原位進(jìn)行更深入的生態(tài)安全性評(píng)估，為漂浮植物濕地單元的構(gòu)建與綜合布署提供更全面的依據(jù)。

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