何苗 張枝雪 趙海榮 巫秀美 趙昱 張成桂

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）02-0182-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.08

摘 要 目的：研究蜜蜂蜂毒（BV）涂膜劑經(jīng)皮給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦血栓大鼠的改善作用。方法：取SD大鼠96只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（生理鹽水）、模型組（涂膜劑空白基質(zhì)）、尼莫地平組（陽性藥物，4.00 mg/kg）和BV涂膜劑低、中、高劑量組（1.67、3.33、6.67 mg/kg），每組16只，假手術(shù)組和尼莫地平組大鼠灌胃給藥，模型組和BV涂膜劑各劑量組大鼠經(jīng)皮涂抹給藥。連續(xù)給藥5 d后，采用結(jié)扎右頸外動(dòng)脈和翼顎動(dòng)脈，同時(shí)頸內(nèi)動(dòng)脈注射復(fù)合血栓誘導(dǎo)劑的方法建立實(shí)驗(yàn)性腦血栓模型。分別測定大鼠右腦/左腦的濕質(zhì)量比以考察梗死側(cè)腦組織水腫程度；采用紫外分光光度法測定大鼠左右半腦中伊文思藍(lán)（EB）含量以考察腦血管通透性；檢測大鼠血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)；采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化，并計(jì)數(shù)存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：經(jīng)與假手術(shù)組各指標(biāo)比較顯示，大鼠腦血栓模型成功建立。與模型組比較，BV涂膜劑各劑量組大鼠右側(cè)（梗死側(cè)）腦組織藍(lán)染面積明顯縮小，右腦/左腦濕質(zhì)量比和右腦組織中EB含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；BV涂膜劑各劑量組大鼠全血黏度和卡松黏度，以及BV涂膜劑中、高劑量組大鼠血漿黏度均顯著降低（P<0.01）；BV涂膜劑中劑量組大鼠凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血活酶時(shí)間顯著延長（P<0.01）；BV涂膜劑各劑量組大鼠腦組織病理學(xué)變化明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)清晰，核仁清晰，胞膜完整，存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.01）。結(jié)論：BV涂膜劑能減輕腦血栓模型大鼠的腦水腫程度，抑制其腦血管通透性，改善腦血栓形成后大鼠血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)，減輕其缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞 蜜蜂蜂毒；涂膜劑；腦血栓；腦水腫；通透性；血液流變學(xué)；凝血功能

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Bee venom（BV） plastics on experimental cerebral thrombosis in rats. METHODS： Totally 96 SD rats were randomly divided into sham operation group （normal saline）， model group （plastics blank matrix）， Nimodipine group （positive drug， 4.00 mg/kg） and BV plastics low-dose， medium-dose， high-dose groups （1.67， 3.33， 6.67 mg/kg）， with 16 rats in each group. Rats in sham operation group and Nimodipine group were given medicine intragastrically， while rats in model group and BV plastics groups were given medicine by transdermal smearing. After 5 days of continuous administration， the experimental cerebral thrombosis model was established by ligating the right external carotid artery and pterygomandibular artery， and injecting compound thrombus inducer into the internal carotid artery. The wet mass ratio of right brain to left brain was measured to investigate the degree of brain edema on the infarcted side. The content of Evans blue （EB） in the left and right hemispheres of rats was determined by ultraviolet spectrophotometry to investigate the cerebral vascular permeability. Blood rheology and coagulation function indicators of rats were measured. The pathological changes of brain tissue in rats were observed by HE staining， and the number of survival neuron cells was counted. RESULTS： Compared with the indexes of sham operation group， the cerebral thrombosis model was established successfully. Compared with model group， the area of blue staining in the right brain （infarcted side） of rats in BV plastics groups was significantly reduced， and the right brain/left brain wet mass ratio and the content of EB in the right brain tissue were significantly reduced （P<0.05 or P<0.01）. The whole blood viscosity and Casson viscosity of rats in BV plastics groups， and the plasma viscosity of rats in BV plastics medium-dose and high-dose groups decreased significantly （P<0.01）. PT and APTT of rats were prolonged significantly in BV plastics medium-dose group （P<0.01）. The pathological changes of brain tissue in rats in BV plastics groups were significantly alleviated. The arrangement of neuron cells was more orderly， the shape and structure of cells were clear， the nucleolus was clear， the membrane was intact， and the number of survival neuron cells was significantly increased （P<0.01）. CONCLUSIONS： BV plastics can alleviate brain edema， inhibit cerebral vascular permeability， improve hemorheology and coagulation function indicators of rats after the formation of cerebral thrombosis， and alleviate nerve cell injury after ischemia.

KEYWORDS Bee vonom； Plastics； Cerebral thrombosis； Cerabral edema； Permeability； Hemorheology； Coagulation function

血栓性疾病是由血管內(nèi)形成血栓和血栓栓塞引起血液流動(dòng)異常所導(dǎo)致的疾病，其發(fā)病率居各種疾病之首，嚴(yán)重危害著人類健康[1]。血栓性疾病常伴有血液黏度增高、血小板聚集活性增高、凝血時(shí)間縮短等現(xiàn)象[2]。蜂毒（Bee venom，BV）是由蜜蜂（Apis mellifera）尾部蟄針排出的一種透明的天然毒素，有多項(xiàng)研究表明，BV具有抗炎[3]、抗凝血[4]、抗血栓[5]的作用，還可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病[6]。蜜蜂BV已上市的劑型主要為注射液，但其過敏和溶血現(xiàn)象嚴(yán)重[7]。基于此，本課題組前期研制出BV涂膜劑，并通過經(jīng)皮給藥研究發(fā)現(xiàn)，該涂膜劑無過敏反應(yīng)，且具有一定的抗血栓作用[8-9]。因此，本研究通過頸內(nèi)動(dòng)脈注入誘導(dǎo)劑建立大鼠腦血栓模型，用以評(píng)估BV涂膜劑對(duì)大鼠腦組織損傷的保護(hù)作用以及對(duì)大鼠血液流變學(xué)和凝血功能的改善作用，旨在為將該涂膜劑開發(fā)為腦卒中治療藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TC-30K型電子天平（江蘇常熟電子儀器廠）；AE240型精密電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；TL-16R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所有限公司）；T96型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SA-7000型全自動(dòng)血液流變測試儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）；CA-620型全自動(dòng)凝血分析儀（上海希森美康醫(yī)用電子有限公司）；AE21型MOTIC倒置顯微鏡（日本Speed Fair公司）；VOR72- X-5型渦旋機(jī)（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KL-UP-UV-20KNSY1059型艾柯超純水機(jī)（成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠）。

1.2 藥品與試劑

BV涂膜劑[實(shí)驗(yàn)室自制（原料藥由大理大學(xué)張成桂副教授提供，涂膜劑空白基質(zhì)以卡波姆為主要原料[10]），批號(hào)：20160517，載藥量：5%]；鹽酸腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：10140701，規(guī)格：1 mL ∶ 1 mg）；尼莫地平片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：BJ29770，規(guī)格：30 mg）；5′-二磷酸腺苷（5′-ADP，批號(hào)：1001918049）、凝血酶（批號(hào)：1001799554）、伊文思藍(lán)（EB，批號(hào)：E2129）均購自美國Sigma公司；水合氯醛（深圳市麗晶生化科技有限公司，批號(hào)：20150325）；丙酮（汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20080617）；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量為250～300 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。大鼠在室溫25 ℃、濕度40%～70%、光照12 h明暗交替的條件下喂養(yǎng)，自由取食飲水（專用標(biāo)準(zhǔn)飼料、純凈水）。本實(shí)驗(yàn)全過程對(duì)動(dòng)物的處置方法符合相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

2 方法

2.1 分組、給藥與造模

取大鼠96只，隨機(jī)分為假手術(shù)組（生理鹽水）、模型組（涂膜劑空白基質(zhì)）、尼莫地平組（陽性藥物，4.00 mg/kg）和BV涂膜劑低、中、高劑量組（1.67、3.33、6.67 mg/kg）[11]，每組16只。給藥劑量根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。尼莫地平組大鼠灌胃尼莫地平溶液（生理鹽水配制），假手術(shù)組大鼠灌胃等體積生理鹽水，給藥體積均為0.1 mL/kg；模型組和BV涂膜劑各劑量組大鼠參照文獻(xiàn)[12]方法，在動(dòng)物太陽穴處（即大鼠目外眥與耳之間連線近1/3處[13]）涂抹給藥。

各組大鼠均連續(xù)5 d預(yù)防用藥，每天1次。于末次給藥后1 h，參考文獻(xiàn)[14-15]方法，分離大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），沿CCA向前分離右頸外動(dòng)脈（ECA），結(jié)扎ECA和CCA向心端，然后向顱底方向分離頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），在顱底小心分離出翼腭動(dòng)脈（PPA）并結(jié)扎其根部，僅保留ICA入顱底主干部分；然后在距遠(yuǎn)心端離結(jié)扎處約1 cm處暫時(shí)夾閉ICA，在右CCA結(jié)扎處和夾閉處之間剪一小口，插入導(dǎo)管，讓少量血液流入導(dǎo)管并放置10 min，使之形成小的栓子；除假手術(shù)組大鼠注射等體積生理鹽水外，其余組大鼠均將此栓子和復(fù)合誘導(dǎo)劑（1.25 mmol/L ADP溶液、1.25萬單位/L凝血酶溶液、1 g/L腎上腺素溶液以體積比100 ∶ 200 ∶ 5混合[16]）按0.1 mL/100 g（體質(zhì)量）緩慢注射入ICA，注射時(shí)打開微動(dòng)脈夾使血管再通，注射完畢后再夾閉，以復(fù)制實(shí)驗(yàn)性腦血栓模型。

2.2 大鼠腦組織水腫程度及腦血管通透性考察

各組取8只大鼠，參考文獻(xiàn)[17]方法，在注射生理鹽水或復(fù)合血栓誘導(dǎo)劑 10 min后，再從CCA的插入導(dǎo)管按0.5 mL/100 g（體質(zhì)量）緩慢注入0.2%EB溶液。10 min后迅速斷頭取腦，用生理鹽水洗去腦組織殘血并以濾紙吸干，將大腦分成左右兩半分別稱定濕質(zhì)量，并計(jì)算右腦/左腦的濕質(zhì)量比，以考察梗死側(cè)腦組織水腫程度。

將左右半腦組織分別置于勻漿器中，按5 mL/g加入0.5%Na2SO4溶液-丙酮混合液（體積比3 ∶ 7），制成勻漿液。將樣本勻漿液置于加蓋試管中，密封，于4 ℃靜置1 h；然后以4 000 r/min離心10 min，取上清液，以空白勻漿液調(diào)零，在620 nm波長下測定吸光度（A）。另取EB適量，以0.5%Na2SO4溶液-丙酮混合液（體積比3 ∶ 7）制成0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8、5.6、6.4、7.8、8.0 μg/mL的系列溶液，分別在620 nm波長處測定A；以EB質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得線性標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.105 3c-0.005 4（r=0.999 6）。將大鼠腦組織樣本勻漿上清液所測A值代入該標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大鼠左右半腦EB含量，以考察大鼠腦血管通透性。

2.3 大鼠血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)檢測

各組剩余8只大鼠在注射生理鹽水或復(fù)合血栓誘導(dǎo)劑后縫合，單籠飼養(yǎng)。24 h后，按0.35 mg/kg（體質(zhì)量）腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠。使用一次性負(fù)壓肝素鈉抗凝管在大鼠腹主動(dòng)脈快速取血4 mL，采用全自動(dòng)血液流變測試儀測定全血低切黏度（10 s-1）、全血中切黏度（60 s-1）、全血高切黏度（200 s-1）、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度；另使用一次性負(fù)壓枸櫞酸鈉抗凝管于大鼠腹主動(dòng)脈快速取血2 mL，采用全自動(dòng)凝血分析儀測定凝血酶時(shí)間（TT）、凝血酶原時(shí)間（PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）及纖維蛋白原（FIB）含量。

2.4 大鼠腦組織病理學(xué)觀察

取“2.3”項(xiàng)下麻醉取血后大鼠，開胸暴露心臟，在左心室心尖部位剪一小口，從該處插灌流管至升主動(dòng)脈根部，用夾子將灌流管固定；在右心耳剪一小口用于灌流液流出，先用100 mL生理鹽水快速灌流，然后使用4%中性多聚甲醛200 mL緩慢灌注。灌流完畢后迅速斷頭取腦，去除嗅球及小腦，置于10%中性緩沖福爾馬林液中繼續(xù)固定24 h。然后在冠狀位視交叉前后切取厚度約為2 mm的腦組織塊，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片（厚度為4～5 μm）。將腦組織切片置于37 ℃溫箱內(nèi)過夜烤干，再進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光鏡下選取右腦組織（梗死側(cè)）3個(gè)視野觀察皮質(zhì)的病理學(xué)變化，并在40×10倍鏡下計(jì)數(shù)單位面積（cm2）中細(xì)胞膜和核膜均完整的存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差檢驗(yàn)（LSD檢驗(yàn)）；不符合正態(tài)性或方差不齊的數(shù)據(jù)，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BV涂膜劑對(duì)大鼠腦組織水腫程度和腦血管通透性的影響

肉眼觀察可見，假手術(shù)組大鼠腦組織無明顯藍(lán)染；模型組大鼠右側(cè)腦組織有明顯藍(lán)染，染色部分涉及到整個(gè)腦半球，包括皮層大部分區(qū)域和尾殼核區(qū)，表明該側(cè)腦組織發(fā)生梗死；尼莫地平組和BV涂膜劑各劑量組大鼠右側(cè)腦組織部分藍(lán)染，但面積明顯縮小。各組大鼠注射EB后腦組織染色圖見圖1，大鼠腦組織冠狀切片各部位解剖示意圖見圖2（注：圖1中箭頭處為藍(lán)色；圖2中CX-1為額頂骨皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)，CX-2為上側(cè)部分額頂骨軀體感覺區(qū)，CX-3為下側(cè)部分額頂骨軀體感覺區(qū)，CP-m為中部尾殼核區(qū)，CP-1為側(cè)邊尾殼核區(qū)）。

梗死側(cè)腦組織水腫程度及腦組織中EB含量測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠右腦/左腦濕質(zhì)量比和右側(cè)腦組織EB含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，尼莫地平組和BV涂膜劑各劑量組大鼠右腦/左腦濕質(zhì)量比和右側(cè)腦組織中EB含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；各組大鼠左側(cè)腦組織中EB含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠右腦/左腦濕質(zhì)量比及左右半腦中EB含量檢測結(jié)果見表1（注：表中各組大鼠因造模時(shí)分血管失敗或后續(xù)死亡等情況導(dǎo)致有不等數(shù)量的減少，故n值有時(shí)低于8，以下各表同）。

3.2 BV涂膜劑對(duì)大鼠血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)的影響

3.2.1 全血黏度 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的全血低切、中切、高切黏度均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，尼莫地平組與BV涂膜劑各劑量組大鼠全血低切、中切、高切黏度均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠全血黏度檢測結(jié)果見表2。

3.2.2 血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組大鼠血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；BV涂膜劑各劑量組大鼠卡松黏度均顯著降低，BV涂膜劑中、高劑量組大鼠血漿黏度均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但紅細(xì)胞聚集指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度檢測結(jié)果見表3。

3.2.3 凝血功能 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PT顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；APTT縮短，F(xiàn)IB含量有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，BV涂膜劑中劑量組大鼠PT和APTT顯著延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；BV涂膜劑各劑量組大鼠FIB含量有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠TT均無明顯變化（P>0.05）。各組大鼠凝血功能指標(biāo)檢測結(jié)果見表4。

3.3 BV涂膜劑對(duì)大鼠腦組織病理學(xué)變化和神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)的影響

鏡下觀察可見，假手術(shù)組大鼠腦細(xì)胞排列整齊，核仁清晰、核圓形，胞膜完整；模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞胞體皺縮、變形，細(xì)胞及血管周圍間隙增大，胞核濃縮著色較深，有神經(jīng)細(xì)胞自溶及壞死現(xiàn)象；尼莫地平組大鼠腦組織細(xì)胞核清晰，未見明顯壞死現(xiàn)象；BV涂膜劑各劑量組大鼠腦組織細(xì)胞核仁清晰，胞膜完整，神經(jīng)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞僅有輕微水腫。存活神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與假手術(shù)比較，模型組大鼠腦組織存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，尼莫地平組和BV涂膜劑各劑量組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠缺血側(cè)腦組織病理學(xué)顯微圖見圖3，存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果見表5。

4 討論

血栓性疾病嚴(yán)重危害著人類健康和生命，而對(duì)于血栓性疾病的研究，有效的動(dòng)物模型是必不可少的。例如Kudo M等[18]采用頸內(nèi)動(dòng)脈注入自體血栓凝塊誘導(dǎo)動(dòng)物形成腦栓塞；Zhang Z等[19]從大鼠ECA逆行插管至ICA，在大腦中動(dòng)脈起始部注入凝血酶誘導(dǎo)血栓形成。目前所報(bào)道的各種腦血栓動(dòng)物模型均有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，其中血栓栓塞法制作局灶性腦梗死動(dòng)物模型更接近人類缺血性卒中病理過程，且不需開顱、創(chuàng)傷小、制作簡單、缺血效果可靠[20]。腦血栓不是通過單一途徑形成的，而是由血管內(nèi)皮損傷與血管收縮、血小板聚集與釋放、纖維蛋白凝固等多種途徑共同誘發(fā)形成[21]。研究證實(shí)，ADP可誘導(dǎo)血小板聚集，使小血管及毛細(xì)血管通透性升高，破壞血腦屏障[22]；凝血酶易使血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，促使血液凝固[23]；腎上腺素能促使血管收縮，增強(qiáng)ADP和凝血酶激活血小板的作用，有助于血栓形成[24]。因此，本課題組綜合上述文獻(xiàn)方法，采用ADP、凝血酶和腎上腺素作為復(fù)合誘導(dǎo)劑，通過結(jié)扎ECA和PPA、從ICA注射該誘導(dǎo)劑和小血栓子從而誘導(dǎo)血栓形成，該造模方法操作簡單、缺血效果可靠，能更好地模擬人體腦血栓發(fā)病的病理生理過程。

尼莫地平作為一種雙氫吡啶類鈣離子拮抗劑[25]，可選擇性地作用于腦血管平滑肌，易通過血腦屏障（BBB），與中樞神經(jīng)的特異性受體結(jié)合，從而擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量，減輕腦水腫，降低血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)[26-27]。因此本研究選擇尼莫地平作為陽性藥物進(jìn)行灌胃給藥，用以驗(yàn)證模型是否成功建立。

BBB是一種高度選擇性滲透屏障，腦缺血性損傷過程中BBB表現(xiàn)為通透性破壞[28]。EB作為一種熒光染料，在BBB被破壞后易進(jìn)入腦組織。同時(shí)，缺血后腦組織缺血缺氧，可使BBB的通透性升高，進(jìn)而引起腦水腫。因此，通過測定腦組織中EB含量可反映腦血管的通透性，測定右腦/左腦濕質(zhì)量比可反映腦組織水腫程度。本研究結(jié)果顯示，建立大鼠腦血栓模型后，模型組大鼠的右腦/左腦濕質(zhì)量比顯著高于假手術(shù)組，表明模型組大鼠右側(cè)腦組織發(fā)生明顯水腫；注射EB后，模型組大鼠右側(cè)腦組織染成藍(lán)色，顱底顏色較深，而左側(cè)腦組織未見藍(lán)染，且模型組大鼠右腦中EB含量明顯高于左腦并高于假手術(shù)組同側(cè)組織。這表明在本研究條件下，大鼠右側(cè)腦梗死模型成功建立。而給予不同劑量的BV涂膜劑進(jìn)行干預(yù)后，大鼠右腦/左腦濕質(zhì)量比和右腦組織中的EB含量都較模型組顯著降低，且肉眼觀察可見其右側(cè)腦組織藍(lán)染面積明顯縮小。這提示BV涂膜劑能抑制復(fù)合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠腦血栓形成，減輕腦水腫并抑制腦血管通透性的增加。

血栓形成后會(huì)導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，使全身或局部的血流速度減慢，在局部形成渦流，并使血液凝血功能異常、血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)異常[29]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度和FIB含量均顯著升高，PT明顯縮短，表明腦血栓模型大鼠的血液呈現(xiàn)高黏稠狀態(tài)。而低、中、高劑量BV涂膜劑干預(yù)能使大鼠全血黏度和卡松黏度均顯著降低；中、高劑量BV涂膜劑干預(yù)能使大鼠血漿黏度顯著降低；此外，BV涂膜劑還能延長大鼠PT和APTT，以中劑量BV涂膜劑的效果較為顯著，推測可能與BV的治療窗較窄有關(guān)；但BV涂膜劑對(duì)FIB和TT的作用效果不明顯。這提示BV涂膜劑能改善模型大鼠血液流變學(xué)，在一定程度上能抑制腦血栓的形成和發(fā)展。

經(jīng)HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織梗死灶中心區(qū)域可見神經(jīng)細(xì)胞排列不規(guī)則、稀疏甚至消失等明顯病理變化，存活神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少；而給予BV涂膜劑干預(yù)后，大鼠腦組織上述病理學(xué)變化明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)清晰，核仁清晰，胞膜完整，存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著增加，表明BV涂膜劑可改善大鼠腦梗死側(cè)神經(jīng)病理學(xué)損傷。

綜上所述，BV涂膜劑能減輕腦血栓模型大鼠的腦水腫程度，抑制其腦血管的通透性，改善腦血栓形成后大鼠的血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)，減輕缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷。

（致謝：感謝大理大學(xué)藥用特種昆蟲國家地方聯(lián)合工程研究中心研究平臺(tái)！感謝國家自然科學(xué)基金委、云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目的支持！感謝所有參與、指導(dǎo)此實(shí)驗(yàn)的老師和同學(xué)?。?/p>

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 孫秀波，付春毅，張亞同，等.新型抗血小板聚集藥物：替格瑞洛的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2015，26（14）：2010- 2013.

[ 2 ] 王輝，劉 剛，羅順德.蓮心堿對(duì)血小板聚集、凝血功能和血栓形成的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（6）：768-772.

[ 3 ] KIM WH，AN HJ，KIM JY，et al. Beneficial effects of me- littin on ovalbumin-induced atopic dermatitis in mouse[J]. Sci Rep，2017，7（1）：1-12.

[ 4 ] ZOLFAGHARIAN H，MOHAJERI M，BABAIE M. Honey bee venom（Apis mellifera）contains anticoagulation factors and increases the blood-clotting time[J]. J Pharmacopunc，2015，18（4）：7-11.

[ 5 ] 劉自元，孟令瑜，吳圍屏，等.蜂毒有效成分分離及其抗血栓作用的研究[J].中國生化藥物雜志，1998，19（6）：381-383.

[ 6 ] KIM JI，YANG EJ，LEE MS，et al. Bee venom reduces neuroinflammation in the MPTP-induced model of Parkinson’s disease[J]. Int J Neurosci，2011，121（4）：209-217.

[ 7 ] 劉紅云，童富淡.蜂毒的研究進(jìn)展及其臨床應(yīng)用[J].中藥材，2003，26（6）：456-458.

[ 8 ] 朱鳳.ZF-3涂膜劑的抗血栓作用研究及其初步安全性評(píng)價(jià)[D].大理：大理大學(xué)，2017.

[ 9 ] 黃茜，胡園，張成桂，等.蜜蜂蜂毒涂膜劑對(duì)SD大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓形成的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥，2017，26（20）：45-49.

[10] 金玲，王錦玉，仝燕，等.涂膜劑研究概述[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（8）：277-280.

[11] 張枝雪，黃茜，李玥，等.膜翅目昆蟲提取物Ento-Ⅱ涂膜劑的鎮(zhèn)痛及活血化瘀作用研究[J].中草藥，2018，49（9）：2108-2113.

[12] 金凡茂，張枝雪，王音，等.Ento-Ⅰ涂膜劑對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].國際藥學(xué)研究雜志，2016，43（3）：504-508、528.

[13] 白妍.電針太陽、印堂穴對(duì)大鼠睡眠功能的神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)及腦電活動(dòng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2004.

[14] 張兆巖，郭述，蘇曹霞，等.大鼠大腦中動(dòng)脈血栓形成模型的建立[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2001，16（6）：423-425.

[15] 齊剛，張莉，李長齡，等.絞股藍(lán)總皂苷對(duì)血小板聚集和血栓形成的影響[J].中草藥，1997，28（3）：163-165.

[16] 李萍，杜洪霞，侯進(jìn)，等.白藜蘆醇對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦血栓形成的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（9）：2391-2392.

[17] 蘇梅，陳群英，段曉波，等.腦脈利顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦血栓模型保護(hù)作用研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2016，21（1）：1-5.

[18] KUDO M，AOYAMA A，ICHIMORI S，et al. An animal model of cerebral infarction：homologous blood clot emboli in rats[J]. Stroke，1982，13（4）：505-508.

[19] ZHANG Z，ZHANG RL，JIANG Q，et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab，1997，17（2）：123-135.

[20] 包玉龍，杜佳林，張宏，等.大鼠腦血栓動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2009，26（6）：50-52.

[21] 甄麗芳.七十味珍珠丸對(duì)缺血性腦卒中動(dòng)物模型藥效學(xué)及機(jī)制的研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2014.

[22] 章靚，陳旺，龐文生，等.血栓形成機(jī)制及血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑的研究進(jìn)展[J].國際藥學(xué)研究雜志，2009，36（4）：268-271.

[23] 郭營營.天麻酚性成分抗血栓形成作用及機(jī)制研究[D].昆明：云南中醫(yī)學(xué)院，2014.

[24] 陳杰.抑肽酶對(duì)血小板PAR1活化保護(hù)機(jī)理的研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2003.

[25] 吳俊華.凝血酶抑制劑研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器，2006，4（5）：3-10.

[26] WURPEL JN，IYER SN. Calcium channel blockers verapamil and nimodipine inhibit kindling in adult and immature rats[J]. Epilepsia，1994，35（2）：443-449.

[27] 李孟，張曉華.尼莫地平的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2013，8（19）：201-202.

[28] 馮金花，魏子孝，李濤.健腦補(bǔ)腎丸聯(lián)合尼莫地平對(duì)血管性癡呆患者血液流變學(xué)和認(rèn)知功能的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（5）：182-184.

[29] 劉信橋，錢冠清，金惠銘.血液流變性障礙在血栓形成中的作用[J].微循環(huán)技術(shù)，1993（2）：104-108.

（收稿日期：2018-05-12 修回日期：2018-11-29）

（編輯：段思怡）