薛文君　宋麗　萬(wàn)四新　李民　李森

摘要：用四川稻瘟病高發(fā)區(qū)的優(yōu)勢(shì)稻瘟病菌生理小種對(duì)引進(jìn)的水稻品種Lemont進(jìn)行抗譜測(cè)試，結(jié)果表明，水稻品種Lemont中含有數(shù)個(gè)控制稻瘟病病斑和病斑數(shù)量的抗性QTL基因；通過(guò)稻瘟病抗性品種Lemont和易感品種麗江新團(tuán)黑谷為親本構(gòu)建了F2作圖群體，利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，Lemont中的兩個(gè)抗瘟性QTL基因位點(diǎn)定位在水稻第八、十一染色體上，可以利用這些標(biāo)記快速檢測(cè)相關(guān)抗性基因，通過(guò)進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)出與這兩個(gè)抗性QTL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，為育種工作更有效地利用抗瘟性基因資源提供便利。

關(guān)鍵詞：水稻；品種Lemont；稻瘟病菌；SSR標(biāo)記；QTL

四川稻區(qū)稻瘟病菌生理小種種類(lèi)多、毒性強(qiáng)、病害發(fā)作頻率高，發(fā)病時(shí)造成水稻產(chǎn)量的較大減產(chǎn)，因而抗稻瘟病的水稻品種受到廣泛的研究，取得的成果相當(dāng)豐富，一些成果也在生產(chǎn)上得到了應(yīng)用，效果明顯。四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種專(zhuān)家連續(xù)對(duì)新育成的具有良好抗病性的五個(gè)水稻品種進(jìn)行大田誘發(fā)稻瘟病實(shí)驗(yàn)，表明Lemont和其他四個(gè)水稻品種都是持久的抗稻瘟病品種；利用稻瘟病表型鑒定和SSR分子標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)相結(jié)合的方法，在第11和第8染色體上檢測(cè)到抗性QTL位點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)室利用分子標(biāo)記快速檢測(cè)水稻中的這些抗性基因和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出與該位點(diǎn)更近更緊密的連鎖分子標(biāo)記打下基礎(chǔ)。

一、材料和方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、水稻鑒定品種、供試水稻品種與菌株。水稻鑒定品種采用國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)水稻品種特特普（tetep）、珍龍13、四豐13、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18與麗江新團(tuán)黑谷中國(guó)7個(gè)統(tǒng)一的鑒別品種（全國(guó)稻瘟病菌聯(lián)合調(diào)查組1979）；供試菌株選用（2015年夏）從四川幾個(gè)稻瘟病流行稻區(qū)分離的120個(gè)菌樣，供試水稻品種為五個(gè)稻瘟病抗性品種和稻瘟病易感品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH），均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

2、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品。PCR儀由BIO—RAD公司提供，主要實(shí)驗(yàn)儀器、藥品及溶液配方參考金冬雁《分子克隆》第二版。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法按照四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供的方法進(jìn)行；親本間的SSR多態(tài)性分析、F2單株葉片DNA提取、PCR反應(yīng)體系參考金冬雁《分子克隆》第二版并做適當(dāng)修改；SSR Marker信息來(lái)自http：∥www.gramene.org網(wǎng)站；遺傳分析與作圖采用MaDmaker/exp3.0版本和Wincart軟件，在水稻第4、6、8、11和12共五條染色體上，分別對(duì)控制病斑數(shù)目和病葉面積作圖，將顯示出與抗性帶型一致的個(gè)體的帶型記做A，與易感帶型一致的個(gè)體的帶型記做B，雜合帶型記做H，輸入到Mapmaker軟件中，進(jìn)行計(jì)算與作圖分析。

二、結(jié)果與分析

（一）稻瘟病菌生理小種的鑒定

在采集的120個(gè)菌樣中，鑒定出了ZB、ZC、ZG、ZE4個(gè)大群，ZB13、ZB21、ZB31、ZB29、ZBl5、ZB32、ZCl5、ZGl、ZEl共9個(gè)生理小種。

2014年與2015年相比，ZB小種呈上升趨勢(shì)。未鑒定出ZA小種，但卻出現(xiàn)了ZC小種。在ZB種群中檢測(cè)出6個(gè)小種。強(qiáng)致病力的ZF小種沒(méi)有檢測(cè)到。

由此可知，四川水稻產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢(shì)稻瘟病菌種群為ZB群，其連續(xù)出現(xiàn)的頻率保持相對(duì)穩(wěn)定，研究人員要重點(diǎn)觀測(cè)ZC、ZB群小種的動(dòng)態(tài)變化并及時(shí)做出預(yù)警，適時(shí)推廣種植對(duì)ZC、ZB群具有抗性的優(yōu)質(zhì)水稻品種。

（二）抗譜測(cè)定

大區(qū)R9等六個(gè)抗性水稻品種與易感黑谷（LTH）大田測(cè)試結(jié)果表明：六個(gè)品種均表現(xiàn)高抗，黑谷表現(xiàn)為高感，這與農(nóng)技人員多年的大田觀測(cè)結(jié)果一致（抗性檢測(cè)見(jiàn)表2、表3）。

（三）親本組合間SSR多態(tài)性分析

用合成的850對(duì)SSR標(biāo)記，在五個(gè)組合間進(jìn)行多態(tài)性篩選。它們與麗江新團(tuán)黑谷的多態(tài)性比率分別為：R9為187/850=22%，R10為146/850=17%，3263為191/850=22.4%，448為206/850=24%，Lemont為83/850=9%。由此可知，在育種上選取差異較大的個(gè)體作為親本進(jìn)行組合，取得的成效相對(duì)明顯。

1、F2定位群體的構(gòu)建及表型鑒定結(jié)果。選取抗性水稻Lemont和易感黑谷（LTH）組合測(cè)試，構(gòu)建作圖群體。

選取B31生理小種接種，共得到917株F2植株。Lemont及正反雜交F1鑒定為抗病，新團(tuán)黑谷為感病，F(xiàn)2群體中抗病株數(shù)：感病株數(shù)=2.84：1；差異性檢測(cè)（p<0.05）表明，實(shí)際觀測(cè)結(jié)果與理論計(jì)算結(jié)果有較大偏差，表明來(lái)自抗性親本lemont中的抗性基因，其遺傳模式由數(shù)量性狀基因決定。

2、引物篩選。找到RM 5766、RM5985共2個(gè)共分離標(biāo)記。用2個(gè)共分離標(biāo)記附近新合成的41對(duì)標(biāo)記在兩親本間尋找多態(tài)性，結(jié)果在11染色體上找到8個(gè)標(biāo)記，在兩親本間有多態(tài)性，在8染色體上找到RM1341、RM27373。

（四）遺傳分析與抗稻瘟病QTL的定位

通過(guò)表型鑒定和分子數(shù)據(jù)分析，美國(guó)光身稻Lemont和麗江新團(tuán)黑谷（LTH）組合中對(duì)B31生理小種的抗性屬于數(shù)量性狀遺傳。由于所篩選到的兩個(gè)共分離標(biāo)記分別位于第11號(hào)和第8號(hào)染色體上，從F2群體中隨即挑取了180個(gè)單株，對(duì)4、6、8、11、12五條染色體作圖。部分多態(tài)性標(biāo)記群體見(jiàn)圖1和圖2。

（五）對(duì)第11號(hào)染色體的QTL分析

用5條染色體上的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)180株F2水稻的DNA，分別以病斑數(shù)目和病葉面積百分?jǐn)?shù)為表型性狀作圖，結(jié)果見(jiàn)表6和圖3。結(jié)果表明，在11號(hào)和第8號(hào)染色體檢測(cè)到抗性QTL，其LOD值均在10以上；以病斑數(shù)目為表型性狀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)11號(hào)染色體上有2個(gè)QTL（qtl1、qtl2），兩個(gè)峰分別位于RM27373與RM27384和RM27381與RM6904之間。以病葉面積百分?jǐn)?shù)為表型性狀檢測(cè)，結(jié)果在8號(hào)染色體上檢測(cè)到兩個(gè)與病葉面積相關(guān)的qtl（qtl3、qtl4）；qtl3在標(biāo)記RM5985和標(biāo)記RM80之間，qtl4在標(biāo)記RM5985和RM223之間，在11染色體上沒(méi)有檢測(cè)到。在8號(hào)和11號(hào)兩條染色體上添加標(biāo)記后作圖，見(jiàn)表4-6。

以控制病葉面積大小為表型性狀，通過(guò)復(fù)合區(qū)間做圖，結(jié)果在8號(hào)染色體上SSR標(biāo)記RM223附近檢測(cè)到二個(gè)控制病葉面積的qtl（qtl3、qtl4）及11染色體上的兩個(gè)qtl。

三、問(wèn)題與討論

本研究以病斑數(shù)和病葉面積為表型性狀，將抗苗瘟的兩個(gè)與病斑數(shù)相關(guān)的QTL定位在11號(hào)染色體上RM27384和RM27373之間及RM6904與RM27381之間；將兩個(gè)與病葉面積相關(guān)的QTL定位在第8號(hào)染色體上RM80與RM5985及RM5985與RM223之間；但是這幾個(gè)QTL對(duì)抗病性的貢獻(xiàn)率都很低，最高的一個(gè)只有24%；最低的一個(gè)只有6.8%，因此，Lemont對(duì)稻瘟病的抗性可解釋為主效QTL加微效QTL共同作用的結(jié)果。初步定位的幾個(gè)QTL離最近的分子標(biāo)記距離較大；在實(shí)際育種中尚有較大差距，可以通過(guò)進(jìn)一步研究，開(kāi)發(fā)出更近的緊密連鎖的分子標(biāo)記用以抗性基因的檢測(cè)。

本研究表明五個(gè)四川水稻品種均具有多個(gè)抗稻瘟病基因，在今后的水稻育種中都是很好的抗性資源，這些水稻品種分別進(jìn)行雜交就可以實(shí)現(xiàn)抗性基因的轉(zhuǎn)移和發(fā)揮其抗性育種的價(jià)值。然而田間觀察到的數(shù)據(jù)還受天氣等自然環(huán)境、時(shí)空條件的影響，還需進(jìn)行連續(xù)的大田觀測(cè)和抗菌實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。