李思 劉曉宇

摘要：【目的】研究辛硫磷暴露對鯽魚肝微粒體中細胞色素P4501a（CYP1A）活性及其mRNA和蛋白表達的影響，明確其劑量—效應(yīng)及時間—效應(yīng)關(guān)系，為揭示有機磷農(nóng)藥對水生生物的代謝調(diào)節(jié)機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā吭O(shè)辛硫磷低、中、高濃度組（0.0825、0.165和0.33 mg/L）和丙酮（助溶劑）對照組，采用半靜態(tài)染毒法染毒鯽魚，分別于染毒24、48、72和96 h后取樣并迅速剖解取出鯽魚肝胰臟，以CYP1A相關(guān)酶7-乙氧基-3-異吩唑酮-脫乙基酶（EROD）活性反映CYP1A活性，采用實時熒光定量PCR和Western blotting分別測定鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表達情況?！窘Y(jié)果】辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性產(chǎn)生抑制作用，辛硫磷染毒24 h時CYP1A活性與辛硫磷存在明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系;各辛硫磷濃度組間均存在明顯的時間—效應(yīng)關(guān)系，至染毒96 h時低、中、高濃度組鯽魚肝微粒體中CYP1A活性分別較對照組下降54.7%、30.4%和65.5%，且差異極顯著（P<0.01，下同）。辛硫磷染毒后，鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA的表達整體上呈明顯下調(diào)趨勢，各染毒時間組間均存在較強的劑量—效應(yīng)關(guān)系，除染毒48 h時CYP1A基因mRNA相對表達量與辛硫磷濃度呈正相關(guān)外，其他染毒時間點均呈負相關(guān)。辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A蛋白表達的影響均達極顯著水平，且呈明顯的劑量—效應(yīng)及時間—效應(yīng)關(guān)系，至染毒96 h時低、中、高濃度組的表達量分別較對照組降低74.6%、82.6%和85.7%?！窘Y(jié)論】辛硫磷能抑制鯽魚肝微粒體中CYP1A活性并下調(diào)CYP1A基因mRNA及其蛋白的表達;相對于辛硫磷產(chǎn)生的劑量—效應(yīng)影響，其對CYP1A活性及其蛋白表達的時間—效應(yīng)影響更明顯。

關(guān)鍵詞： 鯽魚;辛硫磷;肝微粒體;細胞色素P4501a（CYP1A）;活性;表達

中圖分類號： S965.117? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）10-2329-06

Effects of phoxim on the activity and expression of CYP1A in liver microsomes of Carassius auratus gibebio（crucian carp）

LI Si1， LIU Xiao-yu1，2*

（1College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan? 430070， China;

2Key Laboratory of Environment Correlative Dietology， Ministry of Education， Wuhan? 430070， China）

Abstract：【Objective】The effects of phoxim on the activity， mRNA and protein expression of cytochrome P4501a（CYP1A） in crucian carp liver microsomes were investigated， and the dose-dependent and time-dependent relations were studied to provide basis for further exploring the regulatory effects and mechanisms of organophosphorus pesticide on hydrobios. 【Method】Semi-static exposure method was used in the experiment to infect crucian carp.? Low-， mid- and high-dose groups of phoxim（0.0825、0.165、0.33 mg/L） and acetone（solvent） control group，were set up. The crucian carps were sampled and dissected after 24， 48， 72 and 96 h of infection， then hepatopancreas was taken out. CYP1A activity was reflected by the activity of CYP1A-related enzyme 7-ethoxy-3-ethoxyresorufin-O-deethylase（EROD）. The mRNA and protein expression of CYP1A gene in crucian carp liver microsomes were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting， respectively. 【Result】Phoxim had inhibitory effect on the activity of CYP1A， it had obvious dose-dependent manner exposed to phoxim after 24 h and had obvious time-dependent manner in different concentration groups. The activities of CYP1A decreased by 54.7%， 30.4% and 65.5% in low-， mid- and high-dose groups respectively compared with the control group after 96 h and the difference was extremely significant（P<0.01， the same below）. The mRNA expression of CYP1A was significantly down-regulated in crucian carp liver microsomes after infection，and there was a obvious dose-dependent manner at different exposure times. The mRNA expression level of CYP1A was positively correlated with the phoxim concentration after 48 h but negatively correlated with concentration in other exposure times. The effects of phoxim on protein expression of CYP1A in crucian carp liver microsomes all reached extremely significant level， and presented dose-dependent and time-dependent relations. The expression levels after 96 h of exposure at low-， mid- and high-dose groups were decreased by 74.6%， 82.6% and 85.7% respectively compared with the control.【Conclusion】Phoxim can inhibit the activity of CYP1A in the liver microsomes of crucian carp and down-regulate the mRNA and protein expression of CYP1A. Compared with the dose-dependent effect， phoxim has a more obvious time-dependent manner on the activity and protein expression of CYP1A.

Key words： crucian carp; phoxim;? liver microsomes ; cytochrome P4501a（CYP1A）; activity; expression

0 引言

【研究意義】辛硫磷（Phoxim）是一種高效低毒的有機磷殺蟲劑，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于清塘和病蟲害防治（王立梅等，2011;高平等，2014），但施用于田間的辛硫磷可通過地表徑流進入地表水而造成水體污染（湯亞飛等，2004）。辛硫磷對哺乳動物低毒，但對魚類呈現(xiàn)出高毒性，具體表現(xiàn)為在魚體內(nèi)產(chǎn)生蓄積效應(yīng)、損傷組織器官或形成神經(jīng)及生殖毒性影響（Zhang et al.，2010）。細胞色素P450酶（CYP450）是動物體內(nèi)最重要的外源性毒性物質(zhì)代謝酶（Guengerich，2006），而細胞色素P4501a（CYP1A）作為其主要的亞型酶，廣泛存在于魚類的肝微粒體中，在外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，毒性環(huán)境暴露可導(dǎo)致受體介導(dǎo)的CYP1A基因表達變化（Sarasquete and Segner，2000）。因此，研究辛硫磷對水生動物肝臟中CYP1A代謝調(diào)控的影響，明確魚類CYP1A能否作為水產(chǎn)環(huán)境辛硫磷污染的生物標志物，可為監(jiān)測漁藥休藥期及淡水環(huán)境安全問題提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內(nèi)外學(xué)者已開展大量有關(guān)外源性物質(zhì)對水生動物CYP1A影響的研究工作。Hu等（2011）研究了恩諾沙星對鯽魚CYP1A基因mRNA及蛋白表達的影響，結(jié)果顯示恩諾沙星可通過抑制CYP1A基因mRNA及其蛋白表達而進一步抑制CYP1A的催化活性;鄭榕輝等（2012）以褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）為研究對象，開展原油水溶性組分（WSF）對魚肝CYP1A蛋白表達的誘導(dǎo)試驗，以期為建立海洋石油類污染及其生化效應(yīng)的魚肝CYP1A蛋白印跡法生物標志物監(jiān)測技術(shù)提供科學(xué)依據(jù);王英英等（2013）研究表明，構(gòu)建的劍尾魚（Xiphophorus helleri）腦細胞系經(jīng)10-8～10-5 mol/L苯并（a）芘誘導(dǎo)后，CYP1A基因mRNA表達量顯著上調(diào)，且表現(xiàn)出良好的劑量—效應(yīng)關(guān)系，即劍尾魚腦細胞系的建立可為其毒理學(xué)研究提供技術(shù)支持;肖衎（2013）研究發(fā)現(xiàn)，唐魚（Tanichthys albonubes）CYP1A對鎘和銅脅迫的響應(yīng)具有可測性和敏感性，可作為生物標志物用于水環(huán)境重金屬污染監(jiān)測與評價;Li等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，水生環(huán)境污染物三丁基錫的長期暴露能提高幼年鯉魚腦組織中CYP1A基因的轉(zhuǎn)錄水平及抑制7-乙氧基-3-異吩唑酮-脫乙基酶（EROD）活性。其中，有機磷農(nóng)藥對魚類CYP1A的影響研究日益增多。Fu等（2013）分析了2種有機磷農(nóng)藥（阿特拉津和毒死蜱）對鯉魚鰓中CYP1A基因mRNA表達水平的影響;李宏等（2016）通過建立Cocktail探針藥物法分析發(fā)現(xiàn)辛硫磷能抑制鯽魚體內(nèi)的CYP1A活性;Altun等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，毒死蜱暴露下鯉魚腦組織中的CYP1A基因表達呈下調(diào)趨勢。此外，辛硫磷與其他農(nóng)藥如滅多威等聯(lián)用則對魚體產(chǎn)生協(xié)同作用（孟順龍等，2014;余德琴等，2015）?！颈狙芯壳腥朦c】鯽魚是我國重要的大宗淡水魚類之一，位居大宗淡水魚第四位（劉興旺和張海濤，2012），但有關(guān)辛硫磷對鯽魚的毒性影響研究十分有限，至今未見辛硫磷對鯽魚肝微粒體CYP1A活性及其表達影響的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究辛硫磷暴露對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性及其mRNA和蛋白表達的影響，明確其劑量—效應(yīng)及時間—效應(yīng)關(guān)系，為揭示有機磷農(nóng)藥對水生生物的代謝調(diào)節(jié)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用鯽魚購自武漢湯遜湖鯽魚養(yǎng)殖場，平均體重107.0±14.2 g/尾。試驗前將鯽魚置于50 cm×30 cm×20 cm的玻璃水箱內(nèi)馴養(yǎng)1周，養(yǎng)殖用水為充分曝氣除氯后的自來水，增氧機連續(xù)增氧，每日換水1次并清理缸內(nèi)雜物，水溫控制在（25±2）℃。99%辛硫磷分析標準品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;動物組織/細胞總RNA提取試劑盒、第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR qPCR Mix（熒光定量）購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;EROD檢測試劑盒購自江蘇科晶生物科技有限公司;兔抗CYP1A多克隆抗體（GTX128377）購自Gene-Tex公司，兔抗GAPDH多克隆抗體（AB-P-R 001）購自杭州賢至生物科技有限公司，HRP標記羊抗兔lgG二抗（BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器設(shè)備：超高速冷凍離心機（Optima L-90K，Beckman Coulter Inc/USA），熒光定量PCR儀（Qtower 2.2，Analytik Jena AG，German）。

1. 2 引物設(shè)計與合成

參照Zhou等（2011）的方法設(shè)計引物，并委托武漢百捷智生物科技有限公司合成。其中，鯽魚CYP1A基因擴增引物為F1（5'-CATCCCTTTCTTGC GTATCCT-3'）和R1（5'-CGTTTGAGTTCTCGTCCA GTTT-3'），β-actin內(nèi)參基因擴增引物為F2（5'-TCT TTTCCAGCCATCCTTCCTA-3'）和R2（5'-GGTCAG CAATGCCAGGGTA-3'）。

1. 3 試驗設(shè)計

根據(jù)辛硫磷對鯽魚的急性毒性試驗結(jié)果（石旺榮，2011），選取0.0825、0.165和0.33 mg/L（1/40、1/20、1/10的96 h-LC50）分別作為試驗組的低、中、高濃度值;對照組為丙酮（助溶劑）。由于辛硫磷見光易分解，因此整個試驗過程均避光進行，期間持續(xù)充氧，不喂食，且每天及時清理水箱中的排泄物。采用半靜態(tài)染毒法染毒鯽魚，分別于染毒24、48、72和96 h后迅速剖解鯽魚取出肝臟，一部分用于提取RNA，一部分用于提取肝微粒體，提取產(chǎn)物-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 樣品處理

參照陳大健（2006）的提取方法，采用差速離心法制備鯽魚肝微粒體。取出鯽魚肝臟，用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）反復(fù)漂洗以去除紅細胞，置于濾紙上除去多余液體后稱重，轉(zhuǎn)入手持式勻漿器，按1∶4（w/v）比例加入勻漿緩沖液，置冰浴中迅速勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，4 ℃下12000×g離心20 min，棄上層乳白色脂質(zhì)，收集上清液并轉(zhuǎn)移至超高速離心管中，4 ℃下105000×g離心60 min，棄上清液，收集底部呈粉紅色的沉淀（微粒體組分）。按每克肝臟加懸浮緩沖液1.0 mL，振蕩勻后分裝于離心管中，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 鯽魚肝微粒體中CYP1A活性測定

CYP1A活性以其標志酶EROD活性表示，即采用EROD檢測試劑盒進行測定，酶活性以U/L表示。

1. 6 CYP1A基因mRNA表達水平檢測

利用動物組織/細胞總RNA提取試劑盒迅速提取鯽魚肝臟RNA，采用紫外分光光度計檢測OD260/OD280以檢驗RNA濃度和純度，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照SYBR qPCR Mix試劑盒操作說明進行實時熒光定量PCR檢測，擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán);以1 ℃/10 s的速率從65 ℃緩慢遞增至95 ℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1. 7 CYP1A蛋白表達水平檢測

以差速離心法制備的肝微粒體蛋白經(jīng)SDS-PAGE進行初步分離后切下目的條帶，通過電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（GAPDH轉(zhuǎn)膜條件：200 mA，90 min;CYP1A轉(zhuǎn)膜條件：200 mA，120 min），以含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h;以TBST稀釋一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜（GAPDH稀釋比例1∶1000;CYP1A稀釋比例1∶500），TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次;以TBST稀釋HRP標記二抗（1∶50000），使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次;將ECL試劑中的增強液與過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，然后滴加于PVDF膜上，反應(yīng)數(shù)分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，采用BandScan分析膠片灰度值。

1. 8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，包括單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比較。使用GraphPad Prism 5.0進行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2. 1 辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性的影響

以EROD活性反映CYP1A活性，辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性的影響見圖1。整體上，辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性產(chǎn)生抑制作用。辛硫磷染毒24 h時，鯽魚肝微粒體中CYP1A活性與辛硫磷存在明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系，即隨辛硫磷濃度的增加，CYP1A活性抑制作用越明顯;但其他染毒時間的劑量—效應(yīng)影響均不明顯。由圖1還可看出，低、中、高濃度組間均存在明顯的時間—效應(yīng)關(guān)系，染毒時間越長，鯽魚肝微粒體中CYP1A活性越低，至染毒96 h時，低、中、高濃度組鯽魚肝微粒體中CYP1A活性分別較對照組下降54.7%、30.4%和65.5%，且差異極顯著（P<0.01，下同）。

2. 2 辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA表達的影響

辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA表達的影響見圖2。辛硫磷染毒后，鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA的表達整體上呈明顯下調(diào)趨勢，其中，高濃度組染毒24、48、72和96 h時較對照組分別下調(diào)74.9%、65.6%、82.6%和71.4%，其差異均達極顯著水平。在各辛硫磷染毒時間點，鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA相對表達量與辛硫磷存在較強的劑量—效應(yīng)關(guān)系，染毒48 h時CYP1A基因mRNA相對表達量與辛硫磷濃度呈正相關(guān)，其他染毒時間點則呈負相關(guān)，即CYP1A基因mRNA相對表達量隨辛硫磷濃度的增加而降低。低、中濃度組鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA相對表達量在染毒48 h時出現(xiàn)最低值，較對照組分別下調(diào)90.5%和76.8%，之后隨染毒時間的延長其相對表達量逐漸上調(diào);高濃度組鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA相對表達量的最低值出現(xiàn)在辛硫磷染毒72 h時。

2. 3 辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A蛋白表達的影響

辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A蛋白表達的影響見圖3。辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A蛋白表達的影響均達極顯著水平，且呈明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系，即辛硫磷染毒濃度越高，鯽魚肝微粒體中CYP1A蛋白表達量越低（圖4）。辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A蛋白表達的影響還存在明顯的時間—效應(yīng)關(guān)系，至染毒96 h時，低、中、高濃度組鯽魚肝微粒體中CYP1A蛋白表達量分別較對照組降低74.6%、82.6%和85.7%。

3 討論

有機磷農(nóng)藥辛硫磷具有廣譜高效、低成本等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的魚病防治。據(jù)統(tǒng)計，我國每年用于蟲害防治的辛硫磷達5000 t，其中約有80%直接進入生態(tài)環(huán)境，對生物體構(gòu)成潛在危害（臧允亮等，2016;汪鵬鵬等，2017）。CYP1A是CYP450家族中的一個重要亞族，具有高效的催化能力和廣泛的底物活性，許多前毒物及前致癌物代謝活性均與CYP1A密切相關(guān)（Tompkins and Wallace，2007;Zanger and Schwab，2013）。本研究結(jié)果表明，辛硫磷能抑制鯽魚肝微粒體中的CYP1A活性，主要與CYP1A基因mRNA及其蛋白的表達量降低有關(guān)。在辛硫磷染毒初期（24 h），鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表達量與CYP1A活性存在同步變化趨勢，且呈明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系，推測CYP1A在辛硫磷染毒初期直接通過下調(diào)mRNA表達而影響其蛋白表達及酶活性，與外源性物質(zhì)如恩諾沙星對鯽魚肝臟CYP1A（Hu et al.，2011）、黃連素對鯽魚肝臟CYP1A（Zhou et al.，2011）的影響相似。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在辛硫磷染毒48 h時鯽魚肝微粒體中CYP1A基因mRNA表達量與CYP1A蛋白表達量呈負相關(guān)，可能是在翻譯過程中mRNA還受其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如芳烴受體（AhR）會介導(dǎo)原油影響下斑馬魚肝臟中CYP1A基因mRNA的轉(zhuǎn)錄（Sala-berria et al.，2014），且不同結(jié)構(gòu)的AhR激動劑與β-連環(huán)蛋白在調(diào)控CYP1A基因表達過程中存在協(xié)同作用（Vaas et al.，2014）。此外，其他轉(zhuǎn)錄因子如氧化應(yīng)激敏感的NF-κB在參與調(diào)控CYP450基因表達過程中也發(fā)揮重要作用，而且NF-κB和激活子蛋白-1（AP-1）能激活重金屬脅迫下Hepa1c1c7小鼠肝癌細胞CYP1A1基因mRNA的轉(zhuǎn)錄過程（Korashy and El-Kadi，2008）。在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控和翻譯過程中，mRNA和蛋白降解等因素也可能導(dǎo)致mRNA表達與蛋白表達水平不一致（Zanger and Schwab，2013）。本研究結(jié)果表明，辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性的抑制作用與CYP1A蛋白表達呈下調(diào)趨勢有關(guān)，但也存在CYP1A蛋白表達量與CYP1A活性呈負相關(guān)的現(xiàn)象（染毒72和96 h時），可能與蛋白翻譯后的修飾作用存在一定關(guān)聯(lián)，CYP450翻譯后的修飾方式包括磷酸化、泛素化和糖基化等，均會影響最終的酶活性（黎玉華等，2011）。

相對于辛硫磷的劑量—效應(yīng)影響而言，辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性及其蛋白表達的時間—效應(yīng)影響更明顯。在3種不同辛硫磷染毒濃度處理組中，整體上表現(xiàn)為染毒時間越長其抑制作用越明顯，可能是由于隨著染毒時間的推移，鯽魚體內(nèi)未代謝完全的辛硫磷存在蓄積現(xiàn)象（劉茜，2009），進而導(dǎo)致CYP1A蛋白表達受抑制，最終影響酶活性。因此，在鯽魚養(yǎng)殖過程中需格外注意辛硫磷在魚塘中的施用時間，且施用時要控制藥物殘留問題。同時，可將鯽魚CYP1A相關(guān)酶——EROD活性作為水環(huán)境污染的生物標志物，用于監(jiān)控有機磷農(nóng)藥的污染情況，為水產(chǎn)養(yǎng)殖和飲用水安全提供一定的預(yù)警功能。此外，辛硫磷對鯽魚肝微粒體中CYP1A蛋白表達產(chǎn)生的影響可能涉及轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的代謝通路及蛋白翻譯后修飾等方面，其具體分子機制還有待進一步探究。除CYP1A外，CYP450酶系中CYP3A等亞型酶也占有很高的比例，根據(jù)本研究結(jié)果可推測辛硫磷對鯽魚及其他魚類的CYP450代謝亞型酶均產(chǎn)生一定影響，因此不同亞型酶間的相互作用機制也有待進一步研究驗證。

4 結(jié)論

辛硫磷能抑制鯽魚肝微粒體中CYP1A活性并下調(diào)CYP1A基因mRNA及其蛋白的表達;相對于辛硫磷產(chǎn)生的劑量—效應(yīng)影響，其對CYP1A活性及其蛋白表達的時間—效應(yīng)影響更明顯。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）