羅怡琳 蒙正群 周麗軍 王印 姚學萍 楊澤曉 羅燕 耿毅

摘要：采用胰酶消化法培養(yǎng)技術，對乳兔脾臟組織的細胞進行原代培養(yǎng)，從脾臟組織中分離出1株成纖維型細胞，命名為RS-17。通過對細胞傳代培養(yǎng)條件優(yōu)化，細胞標志性蛋白檢測，細胞生長曲線分析，細胞核型以及細胞致瘤性等測定，結果顯示，RS-17細胞具有血清依懶性，成纖維細胞標志性蛋白檢測陽性，具有正常的核型，無致瘤性，且目前細胞傳至95代仍可穩(wěn)定生長。這為RHDV（兔出血癥病毒）感染機制等相關研究提供了細胞材料。

關鍵詞：乳兔;脾臟組織;細胞系;生物學特性;

中圖分類號：$829.1 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0130-06

家兔是具有重要毛用和肉用價值的傳統(tǒng)經濟動物，在中國畜牧業(yè)生產中具有重要地位。兔也是傳統(tǒng)的試驗模式動物，與小鼠、猴、豬等試驗動物相比，體型適中，易操作，且生理結構和調控機制與人類接近，尤其適用于人類心腦血管疾病等研究。

RHDv（兔出血癥病毒）從爆發(fā)以來，國內外學者相繼對該病毒開展了深入研究，在病原學、診斷技術、免疫防控等多方面取得了卓越的進展。但有一個很棘手的問題就是目前對于該病毒尚無穩(wěn)定的培養(yǎng)細胞系統(tǒng)，國內外的研究者曾用60余種動物的原代細胞和傳代細胞培養(yǎng)RHDv，但是均未獲得成功。RHDv培養(yǎng)細胞系的缺乏影響著RHDv的細胞侵染機理和防控等方面的研究，所以探尋出1株合適的細胞系會是研究RHDV侵染機制以及防控該病的重要突破。近年來，隨著細胞生物學以及腫瘤的大量研究，永生化細胞因為有著培養(yǎng)的均一性、穩(wěn)定性和操作簡便性等一系列的優(yōu)點逐漸進入人們視野。本研究偶然獲得1株可穩(wěn)定傳代的兔脾臟成纖維型細胞，對其培養(yǎng)以及建系，為RHDV的侵染研究提供基礎。

1材料與方法

1.1動物

2日齡乳兔，25g 6周齡Balb/c小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2主要試劑

干粉DMEM、胎牛血清（FBs）購自Gibco公司，胰酶、曲拉通x-100透化液、Hoechst33342購于索萊寶公司，青霉素、鏈霉素、碳酸氫鈉、氯化鉀、氯化鈉、牛血清白蛋白BSA等購自博大萬科有限公司，MTT細胞增殖試劑盒、吉姆薩染色液、秋水仙素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，波形蛋白一抗購自武漢博士德公司，角蛋白一抗購自Novus公司，羊抗鼠Alexa Fluor 488二抗購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.5乳兔脾臟原代細胞的培養(yǎng)

原代細胞培養(yǎng)采用酶消化法，在超凈工作臺處死乳兔，并在75%酒精中浸泡1～5 min，在無菌條件下取出脾臟，放置于裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中涮洗，盡量除去組織的血液，轉移到有濾網(wǎng)的無菌培養(yǎng)皿，在濾網(wǎng)上用剪刀剪碎組織，加入適量0.25%胰酶消化，用完全培養(yǎng)液進行沖洗，將液體全部吸入15ml離心管中，放置10 min使大的組織塊自然沉降，然后將上層培養(yǎng)液轉移至底面積為25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，于5%cO，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞貼壁情況以及生長狀態(tài)更換培養(yǎng)液，選擇生長狀態(tài)穩(wěn)定的細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.6乳兔脾臟細胞的傳代培養(yǎng)

待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%～90%時，棄掉培養(yǎng)液，用PBS液清洗3次，加入胰酶消化，在顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓時，加入完全培養(yǎng)基進行終止，輕微吹打使細胞完全從壁上脫離，按1：2進行傳代培養(yǎng)，觀察細胞生長狀況以及形態(tài)，選取生長狀態(tài)良好的細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，每傳2代保存一批細胞。在乳兔脾臟細胞進行傳代培養(yǎng)的過程中，發(fā)現(xiàn)1株生長狀態(tài)良好的細胞，細胞培養(yǎng)至八代時細胞生長緩慢，將細胞傳代轉移到另一個細胞培養(yǎng)瓶，細胞繼續(xù)生長，且生長速度加快，將該細胞株命名為RS-17，并對細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

3討論

長期以來，永生化細胞的建立主要運用于攻克動物疾病研究以及人類醫(yī)學上的相關難題。輻射以及病毒轉染會促使永生的細胞在生長特性以及生物學特性上都會有所改變，而通過端粒酶轉染的細胞保持著正常細胞的特點，所以近20年通過端粒酶建立了大量的人類器官的永生化細胞，如人的視網(wǎng)膜上皮細胞、輸卵管上皮細胞、神經干細胞、成纖維細胞等。同時，大量的動物永生化細胞也通過該方法進行建立，veitonmaki等將hrrERT轉入牛毛細管內皮細胞，將細胞內源性的p16INK4a/p Rb滅活，而使細胞發(fā)生永生化。洪海霞等、蘇正元等通過轉染hTERT質粒構建了豬的血管內皮細胞。本研究中的細胞在培養(yǎng)至8代后，細胞在14 d內基本停止增殖，當把細胞通過胰酶消化轉移到新的培養(yǎng)瓶時，細胞開始生長，且生長速度加快，生長能力以及形態(tài)隨著細胞的繼續(xù)傳代未有明顯改變。而培養(yǎng)了幾批次的原代細胞都在傳至7～9代就開始生長緩慢，傳至10～11代細胞停止生長開始脫落。目前RS-17細胞已傳至95代仍形態(tài)穩(wěn)定，完全超過了細胞正常的生長周期以及傳代次數(shù)，說明RS-17細胞在體外培養(yǎng)的過程中經過自發(fā)或外界因素的影響從增殖衰老危機中逃離而達到了永生化。嚙齒類動物細胞自發(fā)永生化的幾率為10-610-5、0～10-6，這不是第1個乳兔細胞在自然狀態(tài)下達到永生化的案例，1992年，吉傳義等在培養(yǎng)乳兔腎原代細胞的過程中，也偶然獲得了1株轉化的上皮細胞系。

RS-17細胞在培養(yǎng)過程中，貼壁后前期細胞密度小，細胞多為突起的紡錘形以及扁平星形，后期細胞增殖變多后形態(tài)主要為梭形，根據(jù)形態(tài)可初步認定其為成纖維型細胞，進行免疫熒光染色顯示細胞波形蛋白陽性，參照相關研究結果，鑒定該細胞屬于成纖維型細胞。在細胞生長曲線測定中，可見隨著細胞增殖密度加大，有細胞脫落死亡，同時細胞無重疊生長狀態(tài)出現(xiàn).顯示細胞具有正常的生長特性，且具有接觸抑制性，MTI檢測血清依賴性試驗中，3%的血清培養(yǎng)基相對于無血清培養(yǎng)基有著極顯著的促進生長作用，而與5%、10%的血清培養(yǎng)基之間促進作用無顯著差異，說明3%、5%血清培養(yǎng)基可以作為RS-17細胞的培養(yǎng)基：核型觀察細胞染色體為44條，這與家兔的染色體條數(shù)一致，且選取了2個傳代次數(shù)的細胞，在染色體數(shù)目上沒有明顯變化，說明RS-17細胞具有正常的染色體，細胞在注射小鼠后沒有體現(xiàn)出致瘤性。以上試驗結果表明該細胞已經建系成功，為后續(xù)RHDV侵染相關研究提供了科學材料。