唐躍輝 包欣欣 王健 馮荊城 張夢 張慧聰 劉夢蘭 王玉瑾 婁慧敏 閆浩 譚結(jié) 王清偉 劉坤

土壤干旱、鹽堿已成為制約中國農(nóng)作物生長發(fā)育的瓶頸，直接關(guān)系到中國的國家安全和國民經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展，解決這一問題的重要途徑就是大力加強(qiáng)耐逆性相關(guān)基因的挖掘及在分子育種中的開發(fā)利用研究。其中，分子育種以其年限短、效率高和目的性強(qiáng)等特點(diǎn)受到作物育種學(xué)家的高度青睞，是未來作物育種的主要手段。小桐子，又名小油桐、麻瘋樹（Jatropha curca$L.），是大戟科麻瘋樹屬的多年生落葉灌木/小喬木，具有耐土壤瘠薄、耐鹽特別是耐干旱的特性。因此從具有耐受干旱、貧瘠、鹽等特性的小桐子中挖掘耐干旱、耐鹽等高效利用的基因資源，并申請(qǐng)基因?qū)＠Ｗo(hù)，對(duì)農(nóng)作物耐逆品種培育具有重要的農(nóng)業(yè)價(jià)值和應(yīng)用意義。

Dof蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其名稱源于靠近N末端的一段由50個(gè)氨基酸組成的高度保守的c2c2鋅指DNA結(jié)構(gòu)域（命名為Dof結(jié)構(gòu)域），該結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)T/AAAAG基序，直接激活這些基因的表達(dá)，在植物的生長發(fā)育、生物及非生物脅迫響應(yīng)中起重要的調(diào)控作用。相反，Dof蛋白的c末端是非常多變的，該區(qū)域包含蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用域和調(diào)控基序，如位于擬南芥AtDOF4.2和AtDOF4.4蛋白c末端的Thr-Met-Asp基序，該基序主要負(fù)責(zé)AtDOF4.2和AtDOF4.4蛋白的轉(zhuǎn)錄激活能力。根據(jù)Dof蛋白全長氨基酸序列的相似性和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征，擬南芥Dof基因家族成員被分成9個(gè)組，即A、B1、B2、C1、C2.1、C2.C3、D1、D2和D2。近年來，研究者們對(duì)植物尤其是擬南芥和番茄的研究結(jié)果表明，Dof轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的生長發(fā)育、初生和次生物質(zhì)代謝、種子成熟和萌發(fā)、抗逆性、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有重要的調(diào)控作用，如番茄Dof轉(zhuǎn)錄因子S1CDFl和S1CDF3通過直接激活脅迫響應(yīng)基因CORl5、RD29A、RDIO的表達(dá)，增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性：擬南芥Dof家族基因CDF3是一個(gè)正調(diào)控因子，過表達(dá)CDF3基因推遲了擬南芥的開花時(shí)間，增加了擬南芥對(duì)干旱和冷脅迫的抗性：ChIP分析顯示，AtDOF5.4/OBP4通過直接抑制下游基因CyclinBl;1、CDKBl;1和XTH的表達(dá)，負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長：AtDOF4.2通過直接激活細(xì)胞壁松弛因子AtEXPA9的表達(dá).正調(diào)控種子表皮的發(fā)育。這些研究結(jié)果表明，Dof轉(zhuǎn)錄因子主要通過調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而影響植物的生長發(fā)育進(jìn)程。目前，隨著全基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)的發(fā)展，許多物種Dof轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被鑒定和全基因組分析，如擬南芥、水稻、大白菜、辣椒、番茄等。值得注意的是，關(guān)于Dof蛋白的克隆和功能研究主要集中在擬南芥、番茄、水稻等模式植物中，然而，在大戟科物種中尤其在小桐子中鮮有報(bào)道。

目前，對(duì)大戟科物種Dof家族基因的組織特異性及非生物脅迫條件下的表達(dá)模式和功能的研究尚未見報(bào)道，因此，進(jìn)行小桐子Dof轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定、表達(dá)模式和全基因組詳細(xì)分析尤為必要，且亟需進(jìn)行。基于小桐子全基因組測序和不同條件下的表達(dá)譜分析結(jié)果，篩選并鑒定出小桐子Dof基因家族成員，利用生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，全面分析了小桐子Dof家族成員的保守域、系統(tǒng)發(fā)育樹、保守基序、染色體定位，組織特異性表達(dá)及非生物脅迫條件下表達(dá)模式。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究Dof基因在小桐子生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中的潛在功能提供良好的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1材料和方法

1.1植物材料與脅迫處理

小桐子種子來源于中國貴州省，并種植于中國廣東省廣州市中國科學(xué)院華南植物園實(shí)驗(yàn)基地。小桐子干旱、鹽脅迫處理方法參考Tang等進(jìn)行，脅迫處理后，選取根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及qRT-PCR分析，并選取正常生長條件下的根、莖、葉和授粉后14 d和35 d的種子用于組織特異性表達(dá)分析，錫箔紙包裹后立即放入-80℃超低溫冰箱保存待用。

1.2 RNA提取

采用美基生物（Magen，http：//www.magentec.com.cn/）植物RNA提取試劑盒（貨號(hào)R4152-02）進(jìn)行小桐子各組織RNA提取，具體的操作方法參考試劑盒說明書中難提抽植物組織總RNA小量抽提進(jìn)行。采用TaKaRa公司（http：//www.takarabiomed.com.cn/）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)6210A）進(jìn)行第一鏈cDNA合成，具體操作方法參考試劑盒說明書進(jìn)行。

3討論

Dof轉(zhuǎn)錄因子家族基因在植物的生長、發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中起重要的調(diào)控作用。目前，關(guān)于Dof基因克隆及功能的研究主要集中在模式植物中，如擬南芥、番茄等，然而，在非模式植物如小桐子中罕見報(bào)道。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，首次對(duì)小桐子Dof基因的組織特異性和非生物脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行了全面詳細(xì)的分析，總共24個(gè)小桐子Dof蛋白被鑒定。與擬南芥（36個(gè)Dof蛋白）和水稻（30個(gè)Dof蛋白）相比，小桐子包含更少的Dof蛋白，一個(gè)可能的解釋是小桐子Dof家族基因沒有經(jīng)歷大規(guī)模的全基因組倍增事件，然而大規(guī)模倍增事件導(dǎo)致擬南芥和水稻Dof家族基因的擴(kuò)大。

大量的研究結(jié)果表明，系統(tǒng)發(fā)育樹能夠?yàn)椴煌参锿椿蚬δ艿念A(yù)測提供一些有價(jià)值的信息和依據(jù)，如擬南芥、小桐子和水稻ERF或WRKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，位于相同亞組的同源基因在保守基序、表達(dá)模式和功能等方面是相對(duì)保守的;小桐子JcERF034（JcDREB）和它在擬南芥中的同源基因RAP2.4（ATlG78080）屬于A6亞組，JcERF034和RAP2.4都受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并且在擬南芥中過表達(dá)JcERF034或者RAP2.4均增加了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)非生物脅迫的抗性[28-29]。因此，我們構(gòu)建了小桐子、擬南芥和水稻Dof蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，該結(jié)果不僅可以表明擬南芥、小桐子和水稻Dof家族蛋白之間的演化關(guān)系，而且基于已經(jīng)鑒定的擬南芥Dof基因的功能，還可以為小桐子中同源Dof基因功能的預(yù)測提供依據(jù)。AtDOF5.4/OBP4（AT5G60850）和小桐子JcDof11位于A組的同一個(gè)分支，AtDOF5.4/OBP4負(fù)調(diào)控?cái)M南芥細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長，這些結(jié)果表明，JcDofll基因也許參與小桐子細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長的調(diào)控。ATDOF5.8（AT5G66940）、JcDof8和JcDof17都屬于D2組的成員且位于系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支，ATDOF5.8和JcDof8均響應(yīng)干旱、鹽脅迫反應(yīng)且過表達(dá)ATDOF5.8增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)非生物脅迫的抗性，JcDofl7受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這些分析結(jié)果表明，JcDof8和JcDofl7也許在小桐子響應(yīng)非生物脅迫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用?？傊?，系統(tǒng)發(fā)育樹能夠提供一些重要的信息，為小桐子Dof基因功能的研究提供有價(jià)值的依據(jù)。值得注意的是，E組在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成了一個(gè)獨(dú)立的分支，且該組包含8個(gè)水稻Dof蛋白和1個(gè)小桐子Dof蛋白，不包含擬南芥Dof蛋白。該結(jié)果表明，E組的Dof蛋白也許是在水稻、擬南芥、小桐子共同祖先的進(jìn)化過程中，在水稻和小桐子中保存了下來或者是在擬南芥中丟失。

近幾年，越來越多的轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組的研究結(jié)果表明，蛋白序列所含有的保守基序或者功能域在相同的組中是高度保守的，如ERF、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族。然而這些保守基序和系統(tǒng)發(fā)育樹一樣，也能夠?yàn)檠芯课粗虻墓δ芴峁┮恍┯袃r(jià)值的信息。在本研究中，大多數(shù)在同一組中的小桐子Dof蛋白擁有相似的保守基序。這些結(jié)果表明，包含相似保守域的這些Dof蛋白也許在小桐子生長發(fā)育中擁有相似的功能，值得我們進(jìn)一步研究和開發(fā)利用。

通常，基因的表達(dá)模式往往可以為該基因功能的預(yù)測提供一些重要的信息。基于小桐子表達(dá)譜數(shù)據(jù)，我們分析了小桐子Dof基因在根、莖皮層、葉和種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式。JcDof4在根中表達(dá)量最高，其表達(dá)模式和它在擬南芥中的同源基因CDF4（AT2G34140）的表達(dá)模式是相似的，異位表達(dá)CDF4導(dǎo)致根小柱細(xì)胞（Columella cells）提前分化，因此，我們推測JcDof4可能參與小桐子根生長與發(fā)育的調(diào)控。JcDofl3在小桐子種子發(fā)育后期表達(dá)最高，并且它的同源基因AT3G47500在種子成熟期上調(diào)表達(dá)，因此我們推測JcDofl3在小桐子種子成熟期可能起重要的調(diào)控作用。JcDof7在莖皮層有高的表達(dá)，它的同源基因ATlG28310目前還沒有相關(guān)的研究報(bào)道，說明JcDof7或者ATlG28310也許在植物莖發(fā)育與形成中起重要的作用，具體功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。JcDofl4在種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量隨著種子的成熟逐漸增加，且該基因在根、莖皮層和葉中幾乎檢測不到表達(dá)，該結(jié)果表明JcDofl4基因參與種子不同發(fā)育階段的調(diào)控。JcDofl4在擬南芥中的同源基因SCAPl（AT5C，65590）通過調(diào)控氣孔成熟相關(guān)基因的表達(dá)，正調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞（Guard cell）的分化。前人研究結(jié)果表明，Dof基因在植物響應(yīng)非生物脅迫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用。如在擬南芥中過表達(dá)番茄SICDFl基因增加了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽和干旱脅迫的抗性：基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，大多數(shù)大白菜和辣椒Oof基因被鹽和干旱誘導(dǎo)表達(dá)。本研究中，12個(gè)小桐子boy基因響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)，10個(gè)小桐子Oof基因響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)?？傊磉_(dá)譜分析結(jié)果表明，小桐子Oof家族大部分基因在小桐子響應(yīng)非生物脅迫反應(yīng)中也許起重要的調(diào)控作用，它們的功能還需要進(jìn)一步通過試驗(yàn)驗(yàn)證。概括起來，盡管Dof轉(zhuǎn)錄因子全基因組和表達(dá)模式分析不能提供小桐子Oof基因真正的功能，但是小桐子Oof基因表達(dá)模式、系統(tǒng)發(fā)育樹和保守基序分析可以為這些基因在植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中的研究提供有價(jià)值的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

本研究中，總共24個(gè)小桐子Dof蛋白被鑒定。該研究首次全面詳細(xì)地分析了小桐子Dof轉(zhuǎn)錄因子家族基因在正常生長條件和非生物脅迫條件下的表達(dá)模式。小桐子，水稻和擬南芥Dof基因系統(tǒng)發(fā)育樹和不同條件下的表達(dá)模式分析結(jié)果為進(jìn)一步研究Oof基因在小桐子生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中潛在的功能提供有價(jià)值的信息，進(jìn)而促進(jìn)boy基因在小桐子抗逆分子育種中的應(yīng)用。