用進(jìn)化的力量操縱微觀世界

崔佳文 周佳海

2018年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)加州理工學(xué)院教授阿諾德密蘇里大學(xué)教授史密斯和英國(guó)醫(yī)字研究理事會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室教授溫特.以表彰他們?cè)凇懊付ㄏ蜻M(jìn)化”和“肽和抗體噬菌體展示”方面的貢獻(xiàn)。

2018年10月3日，2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)揭曉。美國(guó)加州理工學(xué)院化學(xué)工程系教授阿諾德（F.H.Arnold）獲得一半獎(jiǎng)金，以表彰她在“酶定向進(jìn)化”方面的貢獻(xiàn);另一半獎(jiǎng)金授予美國(guó)密蘇里大學(xué)教授史密斯（G.P.Smith）和英國(guó)醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室教授溫特（G.P.Winter）爵士，以表彰他們?cè)凇半暮涂贵w噬菌體展示”方面的貢獻(xiàn)。

酶和酶的定向進(jìn)化

阿諾德是諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)史上第5位獲獎(jiǎng)女性，之前4位女性是居里夫人（1911年）、居里夫人的女兒伊雷娜（Irene Joliot-Curie，1935年）、霍奇金（D.C.Hodgkin，1964年）和尤納特（A.Yonath，2009年）阿諾德出生在一個(gè)核物理學(xué)家的家庭，受父親的影響，本科就讀于普林斯頓大學(xué)的機(jī)械工程和航天工程專業(yè)，博士階段選擇的是化學(xué)工程，然后轉(zhuǎn)向生物工程。她的哥哥很早就是大學(xué)的病毒學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)教授，在她早期的成長(zhǎng)道路上給予她許多幫助。

酶是一類大分子生物催化劑，目前已知的酶可催化超過(guò)5 000種生化反應(yīng)。大部分的酶是蛋白質(zhì)，少部分的酶是具有催化活性的RNA分子（這些酶被稱作核酶）。與所有催化劑一樣，酶通過(guò)降低反應(yīng)活化能加快化學(xué)反應(yīng)的速率。酶和其他催化劑的不同之處在于，它們的專一性要強(qiáng)得多幾乎所有細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程都離不開酶。酶能大大加快這些過(guò)程中各化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的速率，使代謝產(chǎn)生的物質(zhì)和能量滿足生物體的需求然而，一旦脫離了細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，溫度、酸堿度、鹽濃度、有機(jī)溶劑等外在條件會(huì)極大程度地影響酶的穩(wěn)定性、催化活性以及選擇性，在體外，酶常常無(wú)法發(fā)揮其原本的性能此外，酶催化的專一性也往往決定了它作用的底物單一，難以拓展應(yīng)用到其他非天然底物中為攻克這些弊端，酶的定向進(jìn)化就成了必要的手段。

阿諾德從自然界的進(jìn)化規(guī)律中找到靈感，率先使用定向進(jìn)化技術(shù)來(lái)改造酶（這里僅指用作催化的蛋白質(zhì)，不包括核酶）。她和來(lái)自中國(guó)的陳克勤博士為突破如何找到高效率方法來(lái)改變并篩選出適合特定工業(yè)環(huán)境下、具有催化活性的酶這一瓶頸問(wèn)題，大膽地采用隨機(jī)突變策略，通過(guò)引入突變并連續(xù)提高篩選壓力獲得具有多個(gè)突變組合的酶，這些酶能快速適應(yīng)從來(lái)沒(méi)有接觸過(guò)的工業(yè)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)獲得了十分滿意的結(jié)果[1，2]。他們從一種存在于白然界的枯草桿菌蛋白酶著手研究，率先將其編碼基因進(jìn)行隨機(jī)突變，產(chǎn)生出多種存在著些許差異的枯草桿菌蛋白酶突變體庫(kù)，然后分別檢測(cè)它們?cè)谟袡C(jī)溶劑中的酶活性，從中篩選出活性最高的酶;隨后針對(duì)第一輪得到的酶，再進(jìn)行更多輪次的進(jìn)化篩選，直到找出符合預(yù)期的活性最高的酶。在第三代枯草桿菌蛋白酶中，他們發(fā)現(xiàn)一種突變體溶解在60%二甲基甲酰胺中的催化效率比野生型酶高出256倍，這種活性水平與野生型酶在水溶液中的活性水平相當(dāng)?；诖?，阿諾德提出了“定向進(jìn)化”這一概念，即通過(guò)一定程度地模擬自然進(jìn)化與選擇的過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)引入有益突變，從而改造蛋白質(zhì)的功能[2]。

1998年，阿諾德和來(lái)自中國(guó)的博士生趙惠民發(fā)明了交錯(cuò)延伸技術(shù)t31通過(guò)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，并大大縮短其反應(yīng)時(shí)間，達(dá)到了變換模板和交錯(cuò)延伸的目的。該法簡(jiǎn)便且有效，為酶的體外定向進(jìn)化提供了又一強(qiáng)有力的工具、阿諾德和其他科學(xué)家通過(guò)定向進(jìn)化提高了多種酶的催化活性、熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性、對(duì)底物的立體選擇性，甚至還能夠創(chuàng)造出催化原本自然界中并不存在反應(yīng)的新型酶。

酶定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)的順利開展，離不開酶突變體的產(chǎn)生、多樣化組合和高效篩選。首先，在編碼酶的基因水平上，盡可能多地人為造成隨機(jī)突變或重組，形成一個(gè)龐大的基因突變庫(kù)，然后再表達(dá)出相應(yīng)的酶蛋白突變體庫(kù)。隨后在人工模擬的惡劣環(huán)境或要求下（如高溫、高毒性），從庫(kù)中定向篩選出具理想性狀的蛋自突變體（如高活性、高選擇性、高穩(wěn)定性等）。最后，從選出的突變體中提取其基因作為母本，建立下一輪的酶基因突變庫(kù)，實(shí)現(xiàn)酶的進(jìn)化。

提到酶突變體的多樣化組合技術(shù)，有一個(gè)人不得不提及。他就是已故的施特默爾（W.P.C.Stemmer）博士，他在1994年發(fā)展了一項(xiàng)新的基因改組（DNAshuflling）技術(shù)，讓基因可以在試管里重新“洗牌”[4]。這種技術(shù)首先通過(guò)核酸酶將單個(gè)或一組基因隨機(jī)打斷，再通過(guò)基因擴(kuò)增將它們連接起來(lái)，由于部分基因具有同源性，碎片基因可以實(shí)現(xiàn)錯(cuò)配雜交，當(dāng)A基因和B基因連接在一起時(shí)，會(huì)形成新的組合，可高效地產(chǎn)生多樣性的酶突變體庫(kù)。如果把基因比喻成各種花色和數(shù)字的撲克牌，隨機(jī)點(diǎn)突變就像是某一張或若干張撲克牌隨機(jī)發(fā)生了改變，比如紅桃7變成梅花K，小王變成了大王。而基因改組技術(shù)，則像是拿出不同的牌面洗到一起，由此得到了更豐富的多樣性，也更有可能較快產(chǎn)生擁有優(yōu)良性能的酶。同年，施特默爾利用該技術(shù)對(duì)階內(nèi)酞胺酶成功地進(jìn)行了改組，經(jīng)過(guò)3輪改組和兩輪同野生型DNA的回交，去除了負(fù)突變，篩選到最低抑制濃度的突變子，其活性水平是野生型的32000倍[5]。

酶定向進(jìn)化領(lǐng)域的另一位奠基人是德國(guó)科學(xué)院院士、上海有機(jī)化學(xué)研究所名譽(yù)教授雷茨（M.T.Reeetz），他于1997年首次將定向進(jìn)化的概念和方法應(yīng)用于對(duì)酶的手性改造，并引入到有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，用于不對(duì)稱催化合成，創(chuàng)立了用于酶立體選擇性改造的組合活性中心飽和突變[6]和迭代飽和突變技術(shù)[7]，通過(guò)對(duì)定向進(jìn)化的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和模型設(shè)計(jì)，成功地實(shí)現(xiàn)了將龐大的酶突變體庫(kù)縮小到1000個(gè)以內(nèi)，使定向進(jìn)化的工作開展得更便捷高效。為此，在第九屆國(guó)際生物催化大會(huì)上，他被授予“2018生物催化獎(jiǎng)終身成就獎(jiǎng)”。

噬菌體展示技木

史密斯的貢獻(xiàn)在于發(fā)明了一種名為“噬菌體展示”的新技術(shù)。他將特定蛋白質(zhì)或多肽的遺傳密碼人工插入到編碼噬菌體外殼蛋白基因的適當(dāng)位置，使外源蛋白質(zhì)或多肽隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，它們隨噬菌體的重新組裝而被展示到噬菌體表面[8]。該展示技術(shù)第一次把蛋白質(zhì)和對(duì)應(yīng)的基因在一個(gè)極其簡(jiǎn)單的系統(tǒng)里直接建立了聯(lián)系，解決了之前分子生物學(xué)家最為頭痛的問(wèn)題之一。這些展示的噬菌體可以對(duì)其他蛋自質(zhì)、多肽或者DNA序列一起進(jìn)行識(shí)別和篩選，從而檢測(cè)展示的蛋白質(zhì)與其他分子間的相互作用。在此基礎(chǔ)上所發(fā)展而來(lái)的噬菌體展示克隆技術(shù)可應(yīng)用于活性天然產(chǎn)物（如中藥的有效組分）的靶標(biāo)鑒定。

溫特利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行抗體的定向進(jìn)化，其目的是產(chǎn)生新的藥物[9]。抗體的生產(chǎn)一般是用抗原免疫動(dòng)物而得到，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高昂，此外如果用作藥物，動(dòng)物產(chǎn)生的抗體輸入人體會(huì)被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來(lái)抗原而迅速被消滅掉。噬菌體展示技術(shù)能幫助生產(chǎn)可中和毒性物質(zhì)、對(duì)抗自身免疫疾病的抗體，甚至治愈轉(zhuǎn)移性腫瘤，如今許多暢銷藥品問(wèn)世都有它們的功勞。溫特采用這項(xiàng)技術(shù)制造的第一種藥物“阿達(dá)木單抗”在2002年被正式批準(zhǔn)，用于對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬以及炎癥性腸道疾病的治療。其注射液“修美樂(lè)”連續(xù)6年成為全球“藥王”，2017年貢獻(xiàn)了184.27億美元營(yíng)收。2017年6月，“修美樂(lè)”在中國(guó)又獲批用于治療新的適應(yīng)癥銀屑?。ㄋ追Q牛皮癬），成為中國(guó)首個(gè)用于治療成年中重度慢性斑塊型銀屑病的全人源抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體。噬菌體展示技術(shù)正被大量用于抗體藥物的研發(fā)，目前已上市的抗體藥物中有近十種得益于該技術(shù)的研發(fā)。

人工進(jìn)化的愿景

酶定向進(jìn)化技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)能在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然界進(jìn)化，采用這些技術(shù)，人們可以在體外大大加快生物進(jìn)化的速度，創(chuàng)造出一系列具重要商業(yè)價(jià)值的基因和蛋白質(zhì)，將會(huì)對(duì)人們生活的各個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生革命性的影響。定向進(jìn)化技術(shù)為酶的改造提供了一種全新策略，經(jīng)過(guò)這種方法篩選到的酶能夠突破天然酶的諸多限制，大大拓展了應(yīng)用范圍。定向進(jìn)化不僅可針對(duì)單一的酶進(jìn)行，還可對(duì)一些重要天然產(chǎn)物的生物合成途徑中的不同酶，同時(shí)進(jìn)行改造和優(yōu)化。目前基于定向進(jìn)化技術(shù)獲得的酶，已在藥品制造、可再生能源、環(huán)保行業(yè)等方面得到廣泛應(yīng)用，極大地推動(dòng)了人類的綠色化學(xué)發(fā)展。

在阿諾德的課題組里曾經(jīng)有許多華人科學(xué)家的身影，他們做出了許多開創(chuàng)性的貢獻(xiàn)，比如前面提到的陳克勤、趙惠民，還有現(xiàn)在杜克大學(xué)生物醫(yī)藥工程系任教授的游凌沖、華南理工大學(xué)生物和生物工程學(xué)院的林章凜教授等。他們利用酶定向進(jìn)化技術(shù)在合成生物學(xué)、代謝工程、生物催化、生物制藥等領(lǐng)域都做出了杰出貢獻(xiàn)。

[1]Chen K，Arnold F H.Enzyme engineering for nonaqueous solvents：random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organicmedia.Bio/Technol（N Y），1991，9（11）：1073-1077.

[2]Chen K，Arnold F H.Tuning the activity of an enzyme for unusualenvironments：sequential random mutagenesis of subtilisin E forcatalysis in dimethylformamide.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（12）：5618-5622.

[3]Zhao H，Giver L，Shao Z，et al.Molecular evolution by staggeredextension process（StEP） in vitro recombination.Nat Biotechnol，1998，16（3）：258-261.

[4]Stemmer W P.DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：in vitro recombination far molecular evolution.Proe Natl Acad SciUSA，1994，91（22）：10747-10751.

[5]Stemmer W P.Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling.Nature。1994，370（6488）：389-391.

[6]Reetz M T，Bocola M，Carballeira J D，et al.Expanding the range ofsubstrate acceptance of enzymes：combinatorial active-site saturationtest.Angew Chem Int Ed，2005，44（27）：4192-4196.

[7]Reetz M T，Carballeira J D.Iterative saturation mutagenesis（ISM） forrapid directed evolution of functional enzymes.Nat Protoc，2007，2：891-903.

[8]Smith G P.Filamentous fusion phage：novel expression vectors thatdisplay cloned antigens on the virion surface.Science，1985，228（4705）：1315-1317

[9]McCafferty J，Griffiths A D，Winter G，et al.Phage antibodies：filamentous phage displaying antibody variable domains.Nature，1990，34&（6301）：552-554.

關(guān)鍵詞：定向進(jìn)化 酶工程 噬菌體展示 抗體藥物