李靜雯 葉春雷 陳軍 羅俊杰

摘要：以擬南芥為材料，研究了光調(diào)控因子HY5、HYH在蔗糖脅迫下花青素積累過程中的作用。結(jié)果表明，蔗糖脅迫環(huán)境下誘導(dǎo)的花青素（Anthocyanin）的積累依賴于光，糖脅迫誘導(dǎo)花青素的積累過程必須在光存在的條件下進(jìn)行，在暗處，即使施加高濃度的糖脅迫，也不能明顯的誘導(dǎo)花青素的產(chǎn)生，且在暗處短期內(nèi)不會(huì)因脅迫時(shí)間的延長而改變花青素的積累量。在這個(gè)過程中光調(diào)控因子HY5、HYH起了重要作用。與野生型擬南芥Col-0、WS相比，缺失突變體在糖脅迫環(huán)境下花青素積累明顯減少。

關(guān)鍵詞：蔗糖誘導(dǎo);花青素;HY5;HYH

中圖分類號(hào)：Q503 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2019）01-0021-05

Abstract：Arabidopsis thaliana was used as the material， the effect of light regulator HY5、HYH on anthocyanin accumulation under sucrose stress were studied. The results indicated that the accumulation of anthocyanin induced by sucrose stress depended on light， and the process of anthocyanin accumulation induced by sucrose stress must be carried out in the presence of light. When high concentration of sucrose stress was applied in the dark， the production of anthocyanin could not be obviously induced. The experiment also proved that the accumulation of anthocyanin in the dark would not change with the prolongation of stress time in a short term. In addition， the ?light regulator HY5 and HYH played an important role in this process. Compared with wild type control， the anthocyanin accumulation of deletion mutants decreased significantly under sugar stress.

Key words：Sucrose-induction;Anthocyanin;HY5;HYH

植物在遭受逆境脅迫時(shí)會(huì)表現(xiàn)出一系列的表型特征，通常糖脅迫時(shí)花青素的積累就是一個(gè)重要的表現(xiàn)。已有很多研究表明，花青素對(duì)植物抵抗逆境脅迫起到一定的防御作用，雖然植物本身有一套自己的防御自由基和活性氧威脅的防御系統(tǒng)，但是在逆境脅迫下有時(shí)這套系統(tǒng)不足以抵抗活性氧或者自由基的攻擊，此時(shí)需要花青素發(fā)揮作用，對(duì)細(xì)胞膜和DNA進(jìn)行保護(hù)[1 - 2 ]?；ㄇ嗨氐姆e累情況可以反映植物遭受逆境脅迫的程度，同時(shí)具有對(duì)逆境脅迫所造成的傷害進(jìn)行抵御的作用。目前，一方面由于花青素的純天然特性可以使其在生產(chǎn)、生活等領(lǐng)域得到廣泛的安全利用;另一方面由于其在植物生理方面的有益作用，使對(duì)花青素的研究也得到足夠的重視，尤其花青素對(duì)紫外具有特殊的防護(hù)作用，可以使植物免受紫外的傷害，故很多研究者做了大量的研究工作[3 - 6 ]?；ㄇ嗨氐姆e累受光、溫度、激素等外界因素影響已被證 ? 實(shí)[7 - 10 ]。植物光形態(tài)建成中COP1調(diào)節(jié)的調(diào)控因子HY5、HYH是參與光影響植物的一個(gè)重要的組分[11 - 12 ]，光形態(tài)建成相關(guān)的光調(diào)控因子HY5、HYH在逆境脅迫下對(duì)花青素的積累所起的作用也就不得不引起人們的關(guān)注。我們研究了光調(diào)控因子HY5、HYH在糖脅迫環(huán)境下對(duì)花青素積累的作用，為進(jìn)一步研究HY5、HYH在調(diào)節(jié)花青素抵御逆境的作用提供參考。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 植物材料與培養(yǎng)

以野生型擬南芥Col-0、WS及相應(yīng)的突變體hy5、hyh、hy5 hyh為供試材料。擬南芥種子經(jīng)20%次氯酸鈉消毒13 min，用無菌水沖洗6次，選取均勻飽滿的種子點(diǎn)于直徑10 cm含有25 mL 1/2MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，4 ℃暗處春化2 d后移入21 ℃的溫室萌發(fā)培養(yǎng)4 d。用1/2 MS溶液配制含有不同濃度糖的培養(yǎng)基，對(duì)幼苗處理，進(jìn)行花青素提取測(cè)定。

1.2 ? 花青素的提取與測(cè)定

花青素提取與測(cè)定參照Vandenbussche F方法[13 ]，略有改動(dòng)。取10 mg的整株擬南芥幼苗放入1.5 mL離心管，加入300 μL酸性甲醇（無水甲醇與HCl的體積比為99∶1），于4 ℃冰箱放置24 h，取出后加入氯仿和蒸餾水各200 μL，稍微振蕩后5 000 r/min離心10 min，吸取上清液350 μL加入700 μL 60%（無水甲醇、HCl、水的體積比為99∶1∶200/3）的酸性甲醇稀釋，530 nm波長下測(cè)定吸光值。

1.3 ? 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，用新復(fù)極差法（Duncan）做顯著性分析，利用軟件sigmaplot 10.0和Adobe Photoshop作圖。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 光照條件下蔗糖對(duì)花青素的積累影響

圖1顯示了蔗糖與光對(duì)花青素積累的影響。在蔗糖與光同時(shí)存在的情況下，花青素得到了明顯的積累，且隨著處理天數(shù)的增加效果更為明顯。在只有蔗糖或者只有光存在的情況下，花青素并未得到明顯的積累，這說明蔗糖對(duì)花青素誘導(dǎo)的積累必須在光存在的情況下才可以得到實(shí)現(xiàn)，這也與有關(guān)糖誘導(dǎo)調(diào)節(jié)花青素合成相關(guān)基因的研究相一致[14 - 15 ]。

2.2 ? 蔗糖濃度對(duì)花青素積累的影響

蔗糖濃度不同所引起的糖脅迫程度不同，對(duì)花青素積累的影響程度也就不同。為了選擇合適的糖脅迫濃度，利于花青素的測(cè)定，選擇0、30、60、90、150 mmol/L的蔗糖濃度進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2所示。在低濃度蔗糖（≤90 mmol/L）有光存在下，隨著蔗糖濃度的增加，花青素積累也隨著明顯增加，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到90 mmol/L時(shí)花青素積累已經(jīng)非常明顯，當(dāng)蔗糖濃度再增加時(shí)花青素含量卻沒有再明顯升高。這說明，在90 mmol/L蔗糖濃度下，花青素積累已達(dá)顯著效果，故未特殊說明，均采用90 mmol/L的蔗糖處理。從圖2也可以看出，在暗處雖然也加入了不同濃度蔗糖，但花青素幾乎沒有變化，這也就進(jìn)一步說明糖所誘導(dǎo)的花青素積累依賴于光。

2.3 ? 蔗糖及葡萄糖、 果糖、 山梨醇對(duì)花青素積累影響的比較

在植物的代謝過程中，葡萄糖、果糖是最易利用的單糖。由圖3可知，與二糖（蔗糖）比較，在相同濃度下，對(duì)擬南芥花青素合成影響最大的是蔗糖，而非果糖或葡萄糖，這也為選取蔗糖進(jìn)行處理提供了依據(jù)。另外，無論光下還是暗處，山梨醇所造成的干旱脅迫幾乎不能對(duì)花青素的積累產(chǎn)生影響。圖3還顯示，雖然葡萄糖或果糖在光下與對(duì)照相比花青素的積累有所增加，但是與蔗糖相比，對(duì)花青素合成的影響要微弱的多，也就是說雖然不同的糖脅迫都會(huì)導(dǎo)致花青素產(chǎn)生和積累，但是同濃度的糖的脅迫程度不同，這從花青素的積累程度可以得到驗(yàn)證。這3種糖所誘導(dǎo)的花青素的積累都是依賴于光的，在暗處處理的花青素含量與暗處的對(duì)照幾乎相同。

2.4 ? HY5、 HYH對(duì)蔗糖誘導(dǎo)的花青素的影響

為了進(jìn)一步研究光在蔗糖誘導(dǎo)花青素積累中的作用，用以野生型Col-0為背景的突變體hy5進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，當(dāng)光調(diào)節(jié)因子HY5缺失，在蔗糖處理?xiàng)l件下，花青素的積累量明顯減少，只有對(duì)照組花青素含量的1/2。在未加入蔗糖條件下，突變體hy5與相應(yīng)對(duì)照的花青素含量沒有差別（圖4），這也就說明光調(diào)控因子HY5在蔗糖脅迫誘導(dǎo)的花青素積累過程中起一定的作用，雖然HY5的缺失不能完全抑制蔗糖誘導(dǎo)花青素的產(chǎn)生，但是HY5在此過程中的作用十分重要。

HY5同源基因編碼的光調(diào)控因子HYH對(duì)HY5有一定的互補(bǔ)作用[16 ]，為了進(jìn)一步驗(yàn)證HY5的作用，我們采用野生型WS及相應(yīng)的單突變體hyh和雙突變體hy5 hyh進(jìn)一步進(jìn)行研究。圖5的結(jié)果表明，當(dāng)缺失HYH，在光下蔗糖誘導(dǎo)的花青素的產(chǎn)生量也會(huì)較對(duì)照相應(yīng)的減少，也就是說HYH在蔗糖誘導(dǎo)的花青素積累過程中也是起作用的。從圖5中可以看出，雙突變體與相應(yīng)的野生型和單突變體相比較，花青素的積累量進(jìn)一步降低，這也就進(jìn)一步證實(shí)2個(gè)光調(diào)控因子在蔗糖誘導(dǎo)產(chǎn)生花青素的過程中起到了協(xié)同作用。但是，在2個(gè)因子都缺失的情況下，也不能完全消除蔗糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的花青素，使花青素含量達(dá)到未脅迫的水平。這表明，除了2個(gè)重要的光調(diào)節(jié)因子之外，還存在其它介導(dǎo)途徑的因子存在，有文獻(xiàn)已經(jīng)表明這些調(diào)節(jié)因子在其中的作用[17 ]。

3 ? 結(jié)論與討論

我們通過試驗(yàn)研究了糖脅迫條件下花青素積累對(duì)光的要求，并進(jìn)一步證實(shí)光調(diào)控因子HY5、HYH在這個(gè)過程當(dāng)中所起的作用。結(jié)果表明，糖脅迫誘導(dǎo)花青素的積累過程就必須在光存在的情況下進(jìn)行。在暗處時(shí)，即使施加高濃度的糖脅迫，也不能明顯的誘導(dǎo)花青素的產(chǎn)生，且在暗處短期內(nèi)不會(huì)因脅迫時(shí)間的延長而改變花青素的積累量。有研究認(rèn)為，糖含量的增加有利于花青素的合成[14 ]，但用相同濃度的葡萄糖、果糖處理時(shí)并未達(dá)到采用蔗糖處理的程度，也就是說蔗糖在為花青素合成提供糖源的同時(shí)也造成嚴(yán)重的糖脅迫，進(jìn)而造成花青素的積累。

在負(fù)調(diào)控HY5、HYH的光調(diào)控因子COP1缺失的情況下，擬南芥突變體cop1幼苗黑暗條件下糖處理表現(xiàn)出明顯的花青素積累現(xiàn)象[18 ]。這是由于野生型COP1在暗處能迅速進(jìn)入核內(nèi)降解HY5和HYH，而缺失突變體不具備降解能力，這也間接證明HY5、HYH在調(diào)控花青素積累過程中起到重要作用。我們的研究也表明，調(diào)控因子HY5、HYH在光下低溫引起的花青素積累中具有重要作用，調(diào)節(jié)低溫脅迫下花青素合成基因的表達(dá)，從而影響花青素的積累量[19 ]，這與先前的研究類似。在蔗糖誘導(dǎo)的花青素積累過程中，光形態(tài)建成過程中的這2個(gè)重要調(diào)控因子也起重要作用，但并不是唯一的作用途徑，這也符合植物適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境從而有多條調(diào)節(jié)路徑的進(jìn)化選擇。

參考文獻(xiàn)：

[1] KEVIN S. GOULD. Functioal role of anthocyanins in the leaves of Quintinia serrata A. Cunn[J]. ?Journal of Experimental Botany，2000，51（347）：1107-1115.

[2] MARK N. MERZLYAK. Light absorption by anthocyanins in juvenile，stressed，and senescing leaves[J]. ?Journal of Experimental Botany，2008，59（14）：3903-3911.

[3] 劉 ? 薇，黃 ? 瑛. 植物花青素與生物學(xué)適應(yīng)性關(guān)系研究進(jìn)展[J]. ?作物研究，2005，22（5）：319-322.

[4] 趙云榮，王世雷. ?植物花青素研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（8）：3095-3097.

[5] N M HUGHES，H S NEUFELD. ?Functional role of anthocyanins in high-light winter leaves of the evergreen herb Galax urceolata[J]. ?New Phytologist，2005，168：575-587.

[6] Velissarios-Phaedon Kytridis，Yiannis Manetas. Mesophyll versus epidermal anthocyanins as potential in vivo antioxidants：evidence linking the putative antioxidant role to the proximity of oxy-radical source[J]. ?Journal of Experimental Botany，2006，57（10）：2203-2210.

[7] ELENA LORETI，GIOVANNI PIVEROL. ?Gibberellins，jasmonate and abscisic acid modulate the sucrose-induced expression of anthocyanin biosynthetic genes in Arabidopsis[J]. ? New Phytologist，2008，179：1004-1016.

[8] FABRIZIO PIETRINI，ANGELO MASSACCI. Leaf anthocyanin content changes in Zea mays L. grown at low temperature：Significance for the relationship between the quantum yield of PS II and the apparent quantum yield of CO2 assimilation[J]. ?Photosynthesis Research，1998，58：213-219

[9] CHALKER-SCOTT L. Environmental signi cance of anthocyanins in plant responses[J]. ?Photochemistry and Photobiology，1999，70：1-9.

[10] DEMMIG-ADAMS B. Survey of thermal energy dissipation and pigment composition in sun and shade leaves[J]. ?Plant Cell Physiology， 1998，39：474-482.

[11] CHATTOPADHYAY S. ?Arabidopsis bZIP protein HY5 directly interacts with light-responsive promoters in mediating light control of gene expression[J]. ?Plant Cell，1998，10（5）：673-683.

[12] XING WANG DENG，PETER H QUAIL. Signalling in light-controlled development[J]. Cell and Developmental ?Biology，1999，10：121-129.

[13] VANDENBUSSCHE F，HABRICOT Y. HY5 is a point of convergence between cryptochrome and cytokinin signalling pathways in Arabidopsis thaliana[J]. ?Plant Journal，2007，49：428-441.

[14] CINZIA SOLFANELLI，ALESSANDRA POGGI. Sucrose-specific induction of the anthocyanin biosynthetic pathway in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2006，140：637-646.

[15] JIEUN SHIN，EUNAE PARK. PIF3 regulates anthocyanin biosynthesis in an HY5-dependent manner with both factors directly binding anthocyanin biosynthetic gene promoters in Arabidopsis[J]. ? The Plant Journal，2007，

49：981-994.

[16] JONASSEN EM，LEA US，LILLO C. HY5 and HYH are positive regulators of nitrate reductase in seedlings and rosette stage plants[J]. ?Planta，2008，227（3）：559-64.

[17] SHENG TENG，JOOST KEURENTJES. Sucrose-specific Induction of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis requires the MYB 75/PAP1Gene[J]. ?Plant Physiology，2005，

139：1840-1852.

[18] CHEN Q F，DAI L Y，XIAO S，et al. The COI1 ?and DFR ?genes are essential for regulation of jasmonate-induced anthocyanin accumulation in Arabidopsis[J] . ?Chinese Bulletin of Botany，2007，49 （9）：1370-1377.

[19] ZHANG Y，Z LIU. ?Gibberellins negatively regulate low temperature-induced anthocyanin accumulation in a HY5/HYH-dependent manner[J]. Plant Signal Behav.，2011，6（5）：632-644.

（本文責(zé)編：陳 ? ?珩）

收稿日期：2018 - 09 - 19

基金項(xiàng)目：甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中青年基金（2016GAAS53）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（GARS-17-SYZ-6）;甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（2015GAAS02）;國家自然科學(xué)基金（31660391、31460350）。

作者簡(jiǎn)介：王立光（1982 — ），男，山東臨沂人，助理研究員，博士，主要從事植物分子與生理研究工作。Email：wodepengyouwlg@163.com。

通信作者：羅俊杰（1962 — ），男，陜西華縣人，研究員，主要從事作物栽培與生態(tài)研究工作。 Email： sjsljjie@gsagr.ac.cn。

執(zhí) ?筆 ?人：葉春雷