賴寶春 戴瑞卿 吳振強(qiáng) 李豐 林德峰 王家瑞

摘要：[目的]分析辣椒健康植株和患枯萎病植株根際土壤中細(xì)菌群落多樣性，為辣椒枯萎病生態(tài)防控提供理論依據(jù)。[方法]采集漳州3個(gè)辣椒種植基地枯萎病典型患病樣地的健康植株根際土壤（JK）和患病植株根際土壤（KW），對(duì)土樣中的細(xì)菌群落進(jìn)行基于IlluminaMiseq測(cè)序平臺(tái)的宏基因組高通量測(cè)序，明確健康辣椒植株與枯萎病患病植株根際土壤細(xì)菌多樣性。[結(jié)果]患枯萎病植株根際土壤細(xì)菌的優(yōu)質(zhì)序列比健康植株少14376條，OTUs少1239個(gè)。在門水平上，健康植株和患病植株根際土壤微生物組成相似，但相對(duì)豐度存在差異。在屬水平上，健康植株根際的鞘氨醇單孢菌屬Sphingomonas相對(duì)豐度比患病植株增加了5.05百分點(diǎn);而金屬細(xì)菌屬M(fèi)etallibacterium相對(duì)豐度比患病植株減少了6.09百分點(diǎn)。部分物種豐度分析表明患病辣椒土壤根際中壤紅桿菌屬Solirubrobacter、小雙孢菌屬M(fèi)icrobispora、短鏈球孢囊菌屬Catelliglobosispora和假雙頭斧形菌屬Pseudolabrys等4個(gè)屬的物種豐度低于健康辣椒。[結(jié)論]辣椒患病植株根際土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變及物種豐度降低是辣椒枯萎病患病的重要特征，提示早期添加優(yōu)勢(shì)益生菌是防控辣椒枯萎病的新思路。

關(guān)鍵詞：辣椒枯萎病;根際土壤;高通量測(cè)序;細(xì)菌多樣性

中圖分類號(hào)：S436文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）09-1073-08

0引言

（研究意義）辣椒Capsicum annuum L是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)各地廣泛種植，其中福建漳州地區(qū)主要以種植反季節(jié)辣椒為主。由尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum Schl.引起的枯萎病給漳州辣椒產(chǎn)業(yè)造成極大的威脅。該病害是一種土傳病害，病原菌從辣椒的根部侵入，引起根和莖基部維管束腐爛枯萎。有研究表明，土傳病害的發(fā)生與土壤微生物多樣性存在一定的相關(guān)性。病原菌在微生物多樣性豐富的土壤中很難生存，土傳病害的發(fā)生也會(huì)降低土壤微生物的多樣性。植物根際土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分，可促進(jìn)植株生長(zhǎng)，增強(qiáng)抗病性，在保護(hù)寄主植物免受病原菌侵染等方面有著重要的作用。因此，分析辣椒健康植株和枯萎病患病植株根際細(xì)菌多樣性的變化以及微生物群落結(jié)構(gòu)特征有助于進(jìn)一步了解根際微生物對(duì)辣椒枯萎病發(fā)生的影響，對(duì)辣椒枯萎病的防治具有理論指導(dǎo)意義。（前人研究進(jìn)展）有關(guān)辣椒枯萎病的研究主要集中在生防菌劑分離、篩選及防治方面的研究，如燕嗣皇等應(yīng)用木霉菌劑防治辣椒枯萎病，田間試驗(yàn)結(jié)果表明每1hm用菌劑1.5kg即可有效防治辣椒枯萎病。楊衛(wèi)娟等篩選到一株解淀粉芽孢桿菌對(duì)辣椒枯萎病菌具有較好的抑制作用。鄭玉艷用苦參對(duì)辣椒枯萎病進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明苦參根中所含活性物質(zhì)對(duì)辣椒枯萎病的菌絲和孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用。關(guān)于辣椒根際土壤微生物的研究主要集中在辣椒罹患疫病、不同套種模式、不同基質(zhì)配方等對(duì)辣椒根際土壤微生物的影響方面。如周濤等運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析了3個(gè)地區(qū)辣椒疫病患病根際土壤細(xì)菌群落多樣性，結(jié)果表明3個(gè)地區(qū)辣椒疫病根際土壤微生物組成相似，豐度存在差異。蔡艷等采用常規(guī)方法研究辣椒疫病健康株與患病植株根際土壤與根表土壤微生物數(shù)量、放線菌組成及拮抗性放線菌的分布。徐強(qiáng)等研究不同種植模式、作物種間不同的根部隔離處理對(duì)線辣椒根際與非根際土壤微生物量、酶活性及土壤養(yǎng)分含量的影響，并對(duì)其根際微生物的生態(tài)特征進(jìn)行分析。趙玲等施用不同基質(zhì)配方的有機(jī)肥于連作土壤中，可提高辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)，改善辣椒根際土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)。目前，未見相關(guān)辣椒健康植株與患病植株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析方面的研究報(bào)道。（本研究切入點(diǎn)）傳統(tǒng)研究微生物的分析手段主要針對(duì)可培養(yǎng)微生物，不能準(zhǔn)確分析土壤中微生物群落的多樣性。運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)具有獲得的信息量大、樣品間平行性好等優(yōu)點(diǎn)，可準(zhǔn)確、全面地對(duì)樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。（擬解決的關(guān)鍵問題）通過比較辣椒健康植株和枯萎病患病植株的根際土壤中細(xì)菌多樣性，闡明辣椒根際土壤細(xì)菌多樣性的變化對(duì)枯萎病發(fā)生的影響，為辣椒枯萎病的防控提供理論指導(dǎo)。

1材料和方法

1.1供試材料

土壤樣品于2018年2-3月采自漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（N24°33'13.20”，E117°42'10.98”）、南靖（N24°31'12.15"，E117°19'47.36"）和平和（N24°22'8.58"，E117°20'19.52"）3個(gè)枯萎病患病典型的辣椒種植基地，土壤樣品分別命名為JK土和KW土。JK土為同一田塊中健康植株根際土壤5點(diǎn)取樣的混合土樣;KW土為同一田塊中患病植株根際土壤5點(diǎn)取樣的混合土樣.每個(gè)種植基地選取經(jīng)分子鑒定為健康和患病植株各5株，取土?xí)r，去掉植株殘枝，后用刀從莖基部開始逐漸小心地挖去上層土壤，追蹤根系的伸展方向，后沿須根部分剪下，并將須根、莖帶土取出，采用抖落法采集土壤。土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，置于陰涼通風(fēng)處干燥并過20日土壤篩后，暫存-20℃冰箱.同時(shí)對(duì)3個(gè)基地采集的健康植株和患病植株根、莖分離純化、致病性測(cè)定，鑒定所采集的病株致病菌為辣椒枯萎病菌后，將3個(gè)基地的JK土和KW土按相同比例分別混合均勻并分成2份，一份凍存于-20℃，冷凍干燥后用于提取土壤DNA，另一份凍存于-80℃?zhèn)溆?3個(gè)基地為常年種植同種辣椒品種，施肥管理?xiàng)l件一致，自然條件及土壤性質(zhì)相似。

1.2DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

稱取200mg的樣品，放人滅菌的2mL離心管中，加入1mL70%乙醇，震蕩混勻，10000r·min室溫離心3min，棄置上層液體。加入1×PBS溶液，振蕩混勻，10000r·min室溫離心3min，棄上層液體。倒置2mL管于吸水紙上1min，直至沒有液體流出。將樣品管放人55℃烘箱10min，使殘留酒精完全揮發(fā)。然后使用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取土壤樣品基因組DNA。利用Qubit2.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，確定PCR反應(yīng)需加入的DNA量。

以樣品DNA為模板，使用細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物341F和805R并融合Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4區(qū)通用引物進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增（341F：3'-CCCTACACGACGCTCTTCC

GATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-5'：805R：3'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-5'），擴(kuò)增體系：2×Taq master Mix15uL;10umol·Lprimer F 2uL;模板10～20ngDNA，加水至30uL。PCR反應(yīng)程序：94℃3min;94℃30s，45℃ 20s，65℃ 30s，5個(gè)循環(huán);94℃20s，55℃20s，72℃30s，20個(gè)循環(huán);72℃5min。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，并用0.6倍的磁珠（AgencourtAMPureXP）對(duì)DNA進(jìn)行純化回收。利用Qubit 2.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量并進(jìn)行高通量測(cè)序<生工生物工程（上海）股份有限公司>。

1.3序列數(shù)據(jù)分析

基于Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)原始數(shù)據(jù)做質(zhì)量控制（QC），利用Cutadapt（version 1.2.1）軟件去除接頭序列，用Pear（version 0.9.6）軟件將成對(duì)序列進(jìn)行拼接，調(diào)用Uchime（Version 4.2.40）軟件檢查并去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體，進(jìn)行blastn比對(duì)，獲得高質(zhì)量序列。利用Usearch（version 5.2.236）軟件對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行聚類，相似性≥97%為同一分類操作單元（OTU），使用R的VennDiagram package（version 1.6.16）作圖，通過Venn圖呈現(xiàn)各樣本共有的和獨(dú)有的OTU數(shù)。應(yīng)用Mothur（version 1.30.1）軟件計(jì)算各樣本的Chaol、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)，利用R軟件制作曲線圖，分析樣本微生物群落的Alpha多樣性。通過RDP classifier（version 2.12）（數(shù)據(jù)庫http：//rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）方法進(jìn)行物種分類，即采用Nalve Bayesian assignment算法對(duì)RDP分類閥值≥80%的序列進(jìn)行門（phylum）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）各階層分類，分析各分類層級(jí)水平上每個(gè)樣本群落組成;利用STAMP（Version 2.1.3）軟件進(jìn)行樣本間菌群豐度差異分析，基于物種分類結(jié)果，計(jì)算不同階層水平上各rank的豐度，比較樣本間豐度差異，找出樣本間豐度存在顯著差異的物種分類。

2結(jié)果與分析

2.1 Alpha多樣性分析和OTUs（OperationalTaxonomic Units）差異比較

經(jīng)測(cè)序分析獲得2個(gè)樣品根際土壤細(xì)菌的基因序列為101975條，QC過濾掉低質(zhì)量序列后，有效序列的總數(shù)為95598條，有效率為93.75%;經(jīng)過篩選后的優(yōu)質(zhì)序列數(shù)為75854條，其中，患病植株的根際土壤細(xì)菌的優(yōu)質(zhì)序列比健康植株根際減少14376條。圖1所示，當(dāng)測(cè)序數(shù)量>10000時(shí)，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，Shannon指數(shù)稀釋曲線趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可用于描述整個(gè)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。Alpha多樣性分析表明（表1），健康植株根際土壤的細(xì)菌群落多樣性高于患病植株根際土壤。原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后按97%的序列相似性可劃分為8302個(gè)OTUs（圖2）。其中，健康植株根際細(xì)菌檢測(cè)到7164個(gè)OTUs，患病植株根際細(xì)菌檢測(cè)到5925個(gè)OTUs，比健康植株根際減少了1239個(gè)。健康植株根際和患病植株根際土壤細(xì)菌特有OTUs所占比例各有差異，其中，健康植株根際細(xì)菌特有的OTUs占其總數(shù)的33.17%，患病植株根際細(xì)菌特有的OTUs數(shù)目占其總數(shù)的19.21%。說明患病植株根際細(xì)菌群落與健康植株根際細(xì)菌群落在OTUs水平上存在明顯差異。

2.2細(xì)菌群落組成比較

采用Naive Bayesian assignment算法對(duì)健康植株和患病植株根際土壤細(xì)菌進(jìn)行種系分類，測(cè)得的細(xì)菌群落所有序列可被注釋到30個(gè)門、61個(gè)綱、79個(gè)目、179個(gè)科和516個(gè)屬（表2）。在門的水平下，健康植株根際和患病植株根際占優(yōu)勢(shì)地位的門均為變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes，但在相對(duì)豐度上表現(xiàn)一定的差異，其中Proteobacteria的相對(duì)豐度分別為49.86%和52.25%，Acidobacteria的相對(duì)豐度分別為14.17%和12.5%，Actinobacteria的相對(duì)豐度分別為7.39%和7.76%，Bacteroidetes的相對(duì)豐度分別為5.04%和6.95%。同一優(yōu)勢(shì)菌門Proteobacteria下，健康植株和患病植株的優(yōu)勢(shì)菌綱有所不同，健康植株根際土壤細(xì)菌最優(yōu)勢(shì)菌綱為α-變形菌綱Alphaproteobacteria，其相對(duì)豐度為28.66%，比患病植株增加了10.08百分點(diǎn);而患病植株根際土壤細(xì)菌最優(yōu)勢(shì)綱為γ-變形菌綱Gammaproteobacteria，其相對(duì)豐度為29.04%，比健康植株增加了13.71百分點(diǎn).屬分類水平上，健康植株根際土壤優(yōu)勢(shì)菌屬分別是鞘氨醇單孢菌屬Sphingomonas、芽單孢菌屬Gemmatimonas和產(chǎn)黃桿菌屬Rhodanobacter;而患病植株根際土壤優(yōu)勢(shì)菌屬分別是金屬細(xì)菌屬M(fèi)etallibacterium、產(chǎn)黃桿菌屬Rhodanobacter和鞘氨醇單孢菌屬Sphingomonas;辣椒植株患枯萎病后，根際土壤中Sphingomonas和Gemmatimonas豐度分別減少了5.05百分點(diǎn)和2.2百分點(diǎn)，而Metallibacterium和Rhodanobacter豐度分別增加了6.09百分點(diǎn)和3.56百分點(diǎn)（表3）。

2.3物種豐度差異分析

基于物種分類結(jié)果，計(jì)算在不同水平上各rank的豐度，進(jìn)一步比較健康植株根際和患病植株根際土壤細(xì)菌的物種豐度差異，利用軟件STAMP作圖，獲得了3個(gè)基地健康植株和患病植株根際土壤細(xì)菌的物種差異比較圖（圖3），結(jié)果表明，屬分類水平上，健康植株和患病植株根際土壤細(xì)菌的物種豐度存在差異。在95%置信區(qū)間內(nèi)，壤紅桿菌屬Solirubrobacter、小雙孢菌屬M(fèi)ierobispora、短鏈球孢囊菌屬Catelliglobosispora和假雙頭斧形菌屬Pseudo-labrys等4個(gè)屬存在顯著差異。

3討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究通過Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)漳州3個(gè)種植基地的辣椒根際土壤進(jìn)行宏基因組測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。Shannon指數(shù)、Chaol指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)等3個(gè)指標(biāo)均表明辣椒患病植株根際土壤中的細(xì)菌多樣性要低于健康植株。健康植株根際土壤比患病植株根際土壤擁有更多獨(dú)有的OTUs，患病植株根際土壤細(xì)菌群落中越低的多樣性表明植株發(fā)病程度越高，與前人研究結(jié)果一致。本研究比較了漳州3個(gè)種植基地辣椒健康植株和患病植株根際土壤樣品的OTUs差異，結(jié)果顯示比例存在明顯差異，辣椒健康植株根際細(xì)菌特有的OTUs占其總數(shù)的33.17%，患病植株根際細(xì)菌特有的OTUs數(shù)目占其總數(shù)的19.21%，健康植株比患病植株特有的OTUs多13.96%。

Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes在所有的生物群中均占優(yōu)勢(shì)地位，且在細(xì)菌群落組成上差異不顯著。很多研究結(jié)果表明，在各種不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)門組成具有相似性。本研究中，門分類水平上，健康植株和患病植株根際土壤占優(yōu)勢(shì)地位的門都是Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes，與前人報(bào)道的研究結(jié)果一致。健康植株根際土壤細(xì)菌間和患病植株根際土壤細(xì)菌間優(yōu)勢(shì)門相對(duì)豐度存在差異，但豐度最高優(yōu)勢(shì)菌門都是Proteobacteria。同一優(yōu)勢(shì)菌門Proteobacteria下，健康植株根際際土壤細(xì)菌最優(yōu)勢(shì)菌綱為α-變形菌綱Alphaproteobacteria，其相對(duì)豐度為28.66%，比患病植株增加了10.08百分點(diǎn);而患病植株根際土壤細(xì)菌最優(yōu)勢(shì)綱為γ-變形菌綱Gammaproteobacteria，其相對(duì)豐度為29.04%，比健康植株增加了13.71百分點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單孢菌屬Sphingomonas能夠產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs）細(xì)菌信號(hào)分子，調(diào)控?zé)煵葜参锟共》磻?yīng)，AHLs在生物信息交流中也發(fā)揮著重要的作用，參與細(xì)菌多種生理行為的調(diào)控。鞘氨醇單胞菌廣泛個(gè)分布在各種水體、土壤、大氣以及極端環(huán)境中，有學(xué)者推測(cè)，鞘氨醇單胞菌能夠進(jìn)入植物體內(nèi)與植物共生，并能夠起到拮抗植物致病真菌的作用，同時(shí)它們又是一類致病菌，能引起植物根部或動(dòng)物傷口的感染。本研究中辣椒健康植株根際土壤中的優(yōu)勢(shì)屬為鞘氨醇單孢菌屬，其相對(duì)豐度比患病植株高5.05百分點(diǎn)，鞘氨醇單孢菌在辣椒根際土壤中數(shù)量變化是否與辣椒植株患病直接關(guān)聯(lián)，還有待進(jìn)一步研究。下一步將從土壤中分離鞘氨醇單孢菌，研究其在辣椒土壤生態(tài)環(huán)境中的生理生化特征及其所具備的生態(tài)功能，對(duì)防控辣椒枯萎病具有重要意義。

Vasileiadis等報(bào)道壤紅桿菌屬能提高土壤硝化酶的活性，促進(jìn)土壤微生物硝化作用;Mariana等研究表明，小雙孢菌屬對(duì)白色念珠菌Candidaalbicans、金色葡萄球菌Staphylococcus aureus等病原菌具有較好的抑制作用;短鏈球孢囊菌屬可改善土壤中酶的活性，增加植物光合作用，促進(jìn)植物生長(zhǎng);假雙頭斧形菌屬是植物根際的有益細(xì)菌，能夠促進(jìn)植物對(duì)激素、生物堿以及氮的代謝等，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物抵抗病原菌的能力。本研究結(jié)果表明，辣椒健康和患病植株根際土壤細(xì)菌部分物種豐度差異顯著，在95%置信區(qū)間內(nèi)，壤紅桿菌屬Solirubrobacter、小雙孢菌屬M(fèi)icrobispora、短鏈球孢囊菌屬Catelliglobosispora和假雙頭斧形菌屬Pseudolabrys等4個(gè)屬存在顯著差異，這4個(gè)屬的細(xì)菌在土壤中的功能表現(xiàn)為抑制病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高土壤酶活性及代謝土壤中有害物質(zhì)等。說明辣椒患病與根際土壤中壤紅桿菌屬、小雙孢菌屬、短鏈球孢囊菌屬和假雙頭斧形菌屬的物種豐度降低有關(guān)。

3.2結(jié)論

辣椒患病植株根際土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變及物種多樣性降低是辣椒枯萎病患病的重要特征。其中鞘氨醇單孢菌屬為健康辣椒根際土壤的優(yōu)勢(shì)屬，其在辣椒根際土壤中數(shù)量變化是否與辣椒植株患病直接相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。物種豐度差異分析表明患病辣椒土壤根際中壤紅桿菌屬、小雙孢菌屬、短鏈球孢囊菌屬和假雙頭斧形菌屬等4個(gè)屬的物種豐度低于健康辣椒。該研究結(jié)果有助于我們從辣椒根際土壤中分離到能夠與辣椒共生的優(yōu)勢(shì)益生菌，通過添加益生菌進(jìn)一步驗(yàn)證辣椒枯萎病患病的原因，為早期預(yù)防或生態(tài)調(diào)控辣椒枯萎病提供新的思路。