袁媛 陳志

摘要：miRNA是參與機(jī)體許多生理功能調(diào)控的重要因素之一。本研究以miR- 145為研究對(duì)象，旨在通過(guò)三個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件（rruRanda、PicTar及TargetScan）進(jìn)行miR-145的靶基因的預(yù)測(cè)，以此來(lái)得到miR-145可能靶向FSCN1基因的結(jié)論。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)多重驗(yàn)證篩選miR-145靶基因。研究發(fā)現(xiàn)：在細(xì)胞水平中，miR-145的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致FSCN1的mRNA顯著下調(diào)，當(dāng)miR- 145被抑制表達(dá)的時(shí)候，會(huì)導(dǎo)致FSCN1的mRNA水平顯著上調(diào)。此外，熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)顯示，F(xiàn)SCN1基因的3'UTR存在著miR-145的靶向結(jié)合位點(diǎn)，其在miR- 145的作用下可顯著下調(diào)FSCN1活性。研究結(jié)果將明晰miR-145通過(guò)FSCN1來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能，為探索人類(lèi)及動(dòng)物調(diào)控機(jī)理提供了可靠的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：miR-145;FSCN1;靶基因鑒定;熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

miRNA （MicroRNA）是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，且物種之間有著較高保守性的非編碼RNA。在動(dòng)物中，miR-NA調(diào)控靶基因表達(dá)的典型模式是通過(guò)微小核糖核蛋白復(fù)合體（miRNAP）結(jié)合在靶基因mRNA 3'UTR，以完全堿基配對(duì)或不完全堿基配對(duì)的方式識(shí)別靶基因上的miRNA識(shí)別位點(diǎn)（MREs），導(dǎo)致靶基因的翻譯抑制或者mRNA的降解。有研究報(bào)道，人類(lèi)基因組可轉(zhuǎn)錄上千條miRNA，且超過(guò)60%的編碼蛋白的基因受到miRNA的調(diào)控。miRNA的調(diào)控作用涉及有機(jī)體的各項(xiàng)生命活動(dòng)，參與糖尿病、胰島素抵抗、脂代謝等多種生物學(xué)過(guò)程，研究結(jié)果顯示，miR-145對(duì)機(jī)體免疫有一定的功能和作用。但是關(guān)于miR-145在下游調(diào)控關(guān)系報(bào)道還較少。鑒于此，本研究使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、qRT-PCR等技術(shù)證明，在293-T中探索miR- 145下游靶基因，為探索動(dòng)物和人類(lèi)生理功能調(diào)控提供了可靠的參考價(jià)值。

一、材料和方法

（一）材料

293-T細(xì)胞（揚(yáng)州大學(xué)）、胎牛血清澳洲血源（Gibco： 10099141）、Pierce⑩BCA Protein Assay Kit （Ther-mo，美國(guó)）、Anti-FSCNI antibody（ ab-cam，英國(guó)）、MinuteTM總蛋白提取試劑盒（Invent，美國(guó)）、miR-145 mim-iCS和inhibitor （廣州銳博：R11053.4）、β—actin （13E5） rabbitmAb （CST，美國(guó)）。 （二）miR- 145的mimics和inhibi-tor轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞

由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，miR-145 mimics的最佳轉(zhuǎn)染濃度為lOOnM，miR- 145 inhibitor轉(zhuǎn)染的最佳濃度為300nM。在鋪板24h并且細(xì)胞密度約為80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37℃，5% CO2的狀態(tài)下培養(yǎng)48h。

（三）熒光定量PCR檢測(cè)表達(dá)量

miRNA表達(dá)量的檢測(cè)：對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的RNA提取之后，對(duì)總RNA中的miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)提供的miR- 145序列設(shè)計(jì)定量引物，引物序列為GTCCAGTTTTCCCAC-GAA，下游引物為通用引物，以U6作為內(nèi)參。

mRNA表達(dá)量檢測(cè)：按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，根據(jù)NC-BI上牛FSCNI及內(nèi)參基因CAPDH的序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（見(jiàn)表1）。

（四）miR- 145靶向FSCNI的雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證

使用miRbase在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)所有miR- 145的靶基因，將預(yù)測(cè)到的靶基因使用DAVID在線(xiàn)軟件進(jìn)行分析。本研究構(gòu)建了FSCNI基因3·-UTR野生型的熒光素酶報(bào)告載體及其突變型的載體。FSCN1野生型目的基因帶Sacl和Xhol酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的引物設(shè)計(jì)，用于載體的亞克隆，oligo序列如表2所示。

溶解oligo至50μM，而后選取同體積液體置于1.5ml的離心管中，配成oligo mix。將第一輪的PCR反應(yīng)產(chǎn)物當(dāng)做模板，利用oligo-1及oligo- 12進(jìn)行第二輪的PCR擴(kuò)增。繼而進(jìn)行切膠回收目的基因片段，用Sacl及Xhol對(duì)FSCNI的野生型基因片段進(jìn)行酶切，37C的溫度下進(jìn)行2h的酶切。而后用Sacl及Xhol對(duì)慢病毒載體GP-miRCLO進(jìn)行酶切，同樣是37℃的溫度下進(jìn)行2h的酶切。以上的酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳以后，利用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)回收FSCNI WT基因片段以及GP- miR-GLO進(jìn)行回收。

將經(jīng)過(guò)雙酶切所得到的FSCNIWT基因片段及已經(jīng)線(xiàn)性化的載體，利用DNA T4 ligase連接，按照如下連接體系22℃連接2h。FSCNI突變型基因片段是運(yùn)用突變PCR的方法設(shè)計(jì)突變引物，將靶位點(diǎn)序列突變成TCTGACA（見(jiàn)圖1）。在獲得FSCNI突變目的基因片段以后，后續(xù)的步驟與野生型載體的構(gòu)建相同。

試驗(yàn)一共分成四組來(lái)進(jìn)行：FSCNI WT+ miR- 145 mimic：

FSCNIWT+miR-145 mimic NC; FSCNI Mut+miR-145 mimic：FSCNI Mut+miR-145mimic NC，轉(zhuǎn)染后48h，將培養(yǎng)基吸出。每孔加入75μL的PBS以及75μL的luciferase底物，而后避光進(jìn)行l(wèi)Omin的震蕩，再用酶標(biāo)儀來(lái)進(jìn)行螢火蟲(chóng)熒光素酶的熒光值的測(cè)定。加入75μL的Stop reagent，避光進(jìn)行l(wèi)Omin的震蕩以后，用酶標(biāo)儀來(lái)進(jìn)行海腎熒光素酶的熒光值的測(cè)定，并且計(jì)算出熒光比值。

二、結(jié)果與分析

（一）過(guò)表達(dá)及干擾miR- 145表達(dá)量的效果

在293-T細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR- 145mimics之后，再進(jìn)行熒光定量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的miR- 145要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，表達(dá)量的上調(diào)超過(guò)了114倍。說(shuō)明本次設(shè)計(jì)合成的效果非常顯著，并且已成功轉(zhuǎn)染進(jìn)293-T細(xì)胞系中發(fā)揮其作用。同樣，miR-145 inhibi-tor組的miR- 145表達(dá)量和對(duì)照組進(jìn)行比較以后發(fā)現(xiàn)，降低也呈現(xiàn)了極為顯著的差異（見(jiàn)圖2）。

（二）熒光定量PCR結(jié)果表明miR-145對(duì)FSCNI的表達(dá)具有干擾作用

由圖3可以看出熒光定量PCR的結(jié)果，在293-T細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了miR-145 mimics以后，基因FSCNI的表達(dá)量發(fā)生了極顯著的下調(diào)。與之相反，293-T細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染了miR-145 inhibi-tor干擾了miR- 145的功能之后，F(xiàn)SCNI的表達(dá)量發(fā)生了極顯著的上調(diào)。

（三）雙熒光素酶報(bào)告載體活性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)所挑出的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并且與未酶切的質(zhì)粒均進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，部分質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的克隆并非陽(yáng)性，其余均為陽(yáng)性克隆。FSCNI野生型載體陽(yáng)性克隆的測(cè)序由蘇州吉瑪公司完成，其序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中牛FSCNI基因3'UTR進(jìn)行對(duì)比以后，結(jié)果是一樣的，這表明野生型載體的構(gòu)建是成功。AACUGGA突變?yōu)門(mén)CTGACA，這表明成功構(gòu)建出了FSCNI基因的3'UTR突變型載體。

如圖4所示，與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比以后發(fā)現(xiàn)，miR- 145 WT型載體和miR-145 mimics共轉(zhuǎn)染熒光素酶的熒光值僅為對(duì)照組的64% （P< 0.01）;而FSCNI Mut型載體和miR- 145 mimics共轉(zhuǎn)染熒光值差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由此表明，miR-145可以靶向FSCNI的3'UTR并有效調(diào)控其表達(dá)。

三、討論

近年來(lái)，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，有些DNA序列不編碼任何蛋白質(zhì)分子，卻發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。RNAi的發(fā)現(xiàn)刷新了學(xué)者們對(duì)于RNA分子的調(diào)控基因的表達(dá)功能的認(rèn)識(shí)，可見(jiàn)小分子RNA是基因組內(nèi)的一個(gè)隱藏的信息層，有些學(xué)者將非編碼RNA稱(chēng)為“暗物質(zhì)”。到目前為止miRNA，siRNA以及piRNA是非編碼RNA研究比較透徹的三個(gè)成員。siRNA是另一類(lèi)小分子RNA，其生物合成的作用機(jī)制與miR-NA既有相同之處，也有獨(dú)特之處。本研究使用合成的siRNA作為抑制基因的試驗(yàn)工具，不僅試驗(yàn)效果明顯，而且試驗(yàn)效率高。

在本研究中，三種在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件對(duì)bta- miR- 145的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，而后將bta-miR-145 mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞系中，檢測(cè)預(yù)測(cè)的靶基因FSCNI的mRNA及蛋白表達(dá)的變化情況。bta-miR-145不管是過(guò)表達(dá)或者是抑制表達(dá)，F(xiàn)SCNI的mRNA均會(huì)發(fā)生明顯的改變，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此看出，miR- 145以microRNA最通用的作用機(jī)制——翻譯抑制來(lái)對(duì)FSCNI的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。而bta-miR-145的種子序列UUGACCU與牛FSCNI基因mRNA 3'UTR的一段序列AACUGGA匹配，結(jié)合先前從mRNA水平及蛋白水平分別驗(yàn)證miR- 145過(guò)表達(dá)及干擾以后FSCNI分別產(chǎn)生了下調(diào)及上調(diào)表達(dá)的關(guān)系，由此來(lái)確定FSCNI是miR-145的靶基因。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)是鑒定miRNA與靶基因作用位點(diǎn)的最為常用的方法。因?yàn)樵诓溉閯?dòng)物的細(xì)胞里并未發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)源性螢光素酶，轉(zhuǎn)錄完成無(wú)需翻譯后的修飾，便可生成功能性的螢光素酶，因此，熒光素酶是一種極為理想的報(bào)告基因。螢火蟲(chóng)熒光素酶是一種單亞基蛋白，其大小為6lkDa，作為報(bào)告基因，而海腎熒光素酶同樣是一種單亞基蛋白，其大小為36kDa，作為內(nèi)參校正基因。當(dāng)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性測(cè)量完成以后，螢火蟲(chóng)熒光淬滅，與此同時(shí)，海腎熒光素酶的發(fā)射會(huì)被激活，對(duì)兩者熒光值比值變化進(jìn)行比較，以此可以確定miR-NA對(duì)于預(yù)測(cè)靶基因是否存在作用位點(diǎn)。一般情況下，如果野生型載體的熒光值下調(diào)30%以上，便可表明miR-NA對(duì)靶基因是具有調(diào)控作用的。本研究達(dá)到了40%的一個(gè)水平，可以說(shuō)明miR-145靶向FSCNI。

四、小結(jié)

通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可以篩選出幾個(gè)候選靶基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)最終篩選出FSCNI與miR-145具有靶向關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]Honardoost M，Arefian E，Soleimani M.et al.Development of insulin resistance throughinduction of miRNA- 135 in C2C12 cells[J].Cell Joumal （Yakhteh），2016，18（3）.

[2]Li J，Lu J，Ye Z，Han X，et al.20（S） -Rg3 blockedepithelial- mesenchymal transition throughDNMT3A/miR- 145/FSCNI in ovarian can-cer[J].Oncotarget，2017.8（32）.

[3]2hao H，Kang X，Xia X，et al.miR- 145 sup-presses breast cancer cell migration by tar-geting FSCN-1 and inhibiting epithelial-mesenchymal transition[J].American journalof translational research，2016，8（7）.

[4]Rozalski M，Rudnicka L.Samochocki Z.MiR-NA in atopic dermatitis[J].Advances in Der-matology and Allergology/Postepy Derma-tologii i Alergologii.2016，33（3）.

[5]Yuan Y，Sturgis E M，Zhu L.et al.A function-al variant at the miRNA binding site inE2F1 gene is associated with risk and tumorHPV16 status of oropharynx squaruous cellarcinoma[J].Molecular carcinogenesis.2017.

[6]Rosset C，Vieira I A.Salzano F M，et aI.Agermline variant affects putative mi RNAbinding sites at the F8 3' UTR and acts as apotential haemophilia A phenotype modifierin Southern Brazilian patients[J]. Haemo-philia，2016.22（4）.