楊莉 邱世彥 孫紹霞 韓玉增 張丕強 李玉芬

[摘要]目的 探討白細胞介素（IL）-4-590 C/T位點、IL-13-1112 C/T位點基因多態(tài)性與腸道病毒71（EV71）型手足口病的關系。方法?收集174例EV71型手足口病作為EV71感染組，根據(jù)病情程度分為普通組、重癥組。健康兒童作為正常對照組。采用多重SNP分型技術檢測各組IL-4-590 C/T位點、IL-13-1112 C/T位點的單核苷酸多態(tài)性。結果 感染組IL-4-590 C/T位點TT基因型分布頻率及T等位基因分布頻率均高于對照組，差異有顯著意義（χ2=71.48、88.40，P<0.05），感染組IL-13-1112 C/T位點CC基因型分布頻率及C等位基因分布頻率均高于對照組，差異有顯著意義（χ2=98.58、89.75，P<0.05）。重癥組IL-13-1112 C/T位點CC基因型分布頻率高于普通組，差異有顯著意義（χ2=9.70，P<0.05）。結論 攜帶IL-4-590 位點T等位基因及IL-13-1112位點C等位基因可能與 EV71 感染易感性有關，IL-13-1112 C位點可能與重癥感染有關。

[關鍵詞]手足口病;腸道病毒A型，人;白細胞介素4;白細胞介素13;多態(tài)性，單核苷酸

[中圖分類號]R512.5;R394.25

[文獻標志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0531-05

doi：10.11712/jms201905007

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

腸道病毒71（EV71）是一種單鏈RNA病毒，可導致嬰幼兒手足口病（HFMD）及其神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，發(fā)病率和死亡率均較高。但是，EV71感染的發(fā)病機制還不清楚。人對EV71普遍易感，但不同病人感染后會出現(xiàn)不同的癥狀，這可能與遺傳因素參與調控細胞因子的表達或對細胞因子的反應性而調控機體的免疫狀態(tài)有關。但目前HFMD的易感因素、發(fā)病機制及免疫特點等尚不明了，尤其是EV71致重癥感染的機制、遺傳易感因素目前報道較少。有證據(jù)表明，炎癥細胞因子可能在EV71感染中起重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，促炎性細胞因子白細胞介素（IL）-4-590 C/T位點[1-2]、IL-13-1112 C/T位點[3-4]單核苷酸多態(tài)性（SNP）與某些感染性疾病的發(fā)生發(fā)展及病理進程相關。目前，國內外尚未發(fā)現(xiàn)二者在EV71型HFMD病兒等方面的研究。本研究通過對EV71型HFMD病兒IL-4-590 C/T位點、IL-13-1112 C/T位點基因多態(tài)性研究，探討其在EV71致病過程中可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2017年1月—2018年1月，收集我院兒科診斷為EV71型HFMD病例（感染組）174例，其中男116例，女58例，年齡4個月～6歲，平均（1.92±1.38）歲。診斷標準均符合中華人民共和國衛(wèi)生部制定的《手足口病診療指南（2018年版）》[5]。根據(jù)指南將感染組分為普通組和重癥組：普通組104例，男68例，女36例，年齡4個月～6歲，平均（1.87±1.36）歲;重癥組70例，男48例，女22例，年齡8個月～6歲，平均（1.97±1.41）歲。納入標準：①持續(xù)高熱，體溫大于39 ℃，常規(guī)退熱治療效果不佳;②出現(xiàn)精神萎靡、頭痛、眼球震顫或上翻、嘔吐、易驚、肢體抖動、吸吮無力、站立或坐立不穩(wěn)等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn);③呼吸增快、減慢或節(jié)律不整，安靜狀態(tài)下呼吸頻率超過30 min-1;④心率增快（>160 min-1）、出冷汗、四肢末梢發(fā)涼、皮膚發(fā)花、血壓升高、毛細血管再充盈時間延長（>2 s）;⑤外周血白細胞計數(shù)≥15×109/L，除外其他感染因素;⑥出現(xiàn)應激性高糖血癥，血糖>8.3 mmol/L;⑦出現(xiàn)循環(huán)功能障礙時，血乳酸升高（≥2.0 mmol/L）[5]。排外標準：①患有其他肺部疾病者;②其他原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染者;③檢查不依從者。對照組為同期在本院兒童保健門診體檢且近期無感染癥狀的正常兒童66例，其中男34例，女32例，年齡7個月～4歲，平均（1.95±1.28）歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準及受試者家屬知情同意。

1.2 實驗方法

收集3組受試者靜脈血2 mL（入院24 h內），采用EDTA抗凝，-80 ℃儲存。提取外周血DNA，采用NanoDrop 2000進行基因組質控，基因組濃度為50～100 mg/L，OD（260/280）值為1.8～2.0，每個反應需要DNA的量為50 ng。采用多重SNP分型技術檢測EV71型HFMD感染病兒及正常對照兒童IL-4-590 C/T位點、IL-13-1112 C/T位點的SNP。針對檢測的單基因設計引物，所用軟件為：Primer Z。所用引物序列如下。IL4-590F：GCCA-AGGGCTTCCTTATGGG;IL4-590R：GGCCACA-GGTGTCCGAATTT;IL13-1112F：CACACCCTTGTGAGGAGGTT;IL13-1112R：CCCACTGTGAGAGGGATTGT。稀釋引物，然后根據(jù)引物條件進行PCR擴增，使用的儀器為ABI PCR擴增儀。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料正態(tài)分布的以[AKx-D]±s表示，組間比較使用獨立樣本均數(shù)的t檢驗;偏態(tài)分布的以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）（M（P25，P75））表示，組間比較使用獨立樣本非參數(shù)檢驗的Mann-Whitney U法;計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。應用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測樣本是否達到遺傳平衡。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律檢測

基于遺傳平衡定律，對EV71感染組和正常對照組IL-4-590 C/T、IL-13-1112 C/T位點各基因頻率分別進行檢驗，所得P值均>0.05，本研究符合遺傳平衡定律。

2.2 各組IL-4-590 C/T位點基因多態(tài)性分布比較

感染組IL-4-590 C/T位點TT基因型分布頻率、T等位基因分布頻率均高于對照組，差異有顯著意義（χ2=71.48、88.40，P<0.05）。該位點T、C等位基因分布頻率在EV71型HFMD普通組與重癥組間差異無顯著統(tǒng)計學意義（χ2=2.56、0.14，P>0.05），見表1。

2.3 各組IL-13-1112 C/T位點基因多態(tài)性分布

感染組IL-13-1112 C/T位點CC基因型分布頻率及C等位基因分布頻率均高于對照組，差異有顯著意義（χ2=98.58、89.75，P<0.05）。重癥組病人IL-13-1112 C/T位點CC基因型分布頻率高于普通組病人，差異有顯著意義（χ2=9.70，P<0.05），C等位基因分布頻率在EV71型HFMD普通組與重癥組的分布差異無顯著統(tǒng)計學意義（χ2=2.82，P>0.05）。見表2。

3 討論

HFMD是以手掌、腳掌及口腔黏膜上發(fā)生水皰為特征的一種病毒性皮膚病，其病原體以EV71最為常見。由于EV71具有嗜神經(jīng)性，感染病人易出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損害，并進一步進展為危重病人而導致死亡。然而，關于EV71型HFMD的發(fā)病機制目前尚不明了。近年來多種細胞因子與HFMD發(fā)病機制的關系成為研究的熱點。細胞因子網(wǎng)絡的失衡可能參與了EV71型HFMD的發(fā)病機制[6]。目前認為與EV71型HFMD有肯定意義的細胞因子有IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、成纖維細胞刺激脂肽-1（FSL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等[7-16]。已有研究結果表明，在小鼠EV71病毒感染模型IL-5、IL-13、IL-6等水平顯著上升[17]，在感染的早期階段，這些因素可能預示著嚴重的后果。HUANG等[18]發(fā)現(xiàn)，IL-35的調節(jié)與Treg/Th17平衡有關，在EV71相關HFMD的發(fā)病機制中可能起著至關重要的作用。SHANG等[19]研究顯示，輕癥HFMD病人IL-4、IL-12和IL-18水平升高，在重癥HFMD病人中，腦炎合并肺水腫者IL-12水平高于單純腦炎病人。這些研究結果表明，全身性炎癥反應可能在HFMD的發(fā)病機制中起重要作用。

人對EV71普遍易感，但不同病人感染后會出現(xiàn)不同的癥狀，這可能與遺傳因素參與調控細胞因子的表達有關。在眾多遺傳因素中，宿主基因的SNP是個體間遺傳差異的本質因素之一。EV71 易感相關基因多態(tài)性研究及其與疾病病程發(fā)展相互間的聯(lián)合分析，是今后針對 EV71感染精準醫(yī)療的研究重點。 ZHAO等[20]研究表明，重癥EV71感染病人血IL-10水平及IL-10-592 C等位基因頻率顯著高于中度病例、輕度病例和健康兒童，并認為IL-10-592 C等位基因與中國人EV71感染的嚴重程度相關。LI等[21]發(fā)現(xiàn)，IL-17F rs1889570基因多態(tài)性與中國漢族兒童嚴重EV71感染的易感性顯著相關。本研究對與EV71型HFMD的發(fā)病過程有密切關系且目前報道較少的炎性細胞因子IL-13及IL-4進行了探討。IL-4定位于染色體 5q31，其蛋白作為 Th2 細胞分泌的主要細胞因子介導機體體液免疫反應。EV71 感染病人體內IL-4 含量增高，且隨著疾病的進展持續(xù)增加[22]。IL-4序列分析顯示該基因存在多態(tài)性位點，特別是 IL-4 基因啟動子區(qū)，如IL-4-590 C/T 基因多態(tài)性位點。該位點與 IL-4 產(chǎn)生、活性及功能關系密切。研究發(fā)現(xiàn)，EV71感染HFMD病人IL-4-590對晚發(fā)性阿爾茨海默病有保護作用[2]，并與鱗狀細胞肺癌、牙周炎、兒童特應性皮炎、類風濕性關節(jié)炎、副球孢子菌病、瘧疾易感等有關[23-26]。IL-13是一種Th2起源的抗炎性細胞因子，其生物學作用包括誘導巨噬細胞樹突樣變、抑制單核細胞釋放炎性細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，EV71感染HFMD病人IL-13水平顯著高于非EV71感染HFMD病人和健康人[27-29]。而IL-13-1112基因多態(tài)性與多種疾病的關系已有較多報道，其對皮膚T細胞淋巴瘤有保護作用[4]，與牙周炎、慢性阻塞性肺疾病及炎癥性腸?。↖BD）和結直腸癌易感性有關[3，30-31]。關于IL-4-590和IL-13-1112基因多態(tài)性的聯(lián)合研究結果顯示，雜合基因型（IL-4-590CT和IL-13-1112CT）可作為2型糖尿病發(fā)病的危險因素，而純合野生型（-590CC和-1112CC）可作為2型糖尿病的保護因素[32]。但二者在EV71型HFMD中鮮有報道。

本研究分析了在HFMD病情發(fā)展中起作用的IL-4及IL-13基因多態(tài)性與EV71感染及嚴重程度的關系，發(fā)現(xiàn)EV71 感染組IL-4-590 C/T位點TT、CT分布頻率明顯高于對照組，T等位基因分布頻率明顯高于正常對照組，提示人群中該位點變異等位基因T為主要的攜帶基因且攜帶者更容易罹患EV71型HFMD，其可能與 EV71 感染易感性有關。EV71 感染組IL-13-1112 C/T位點基因CT及CC基因型分布頻率明顯高于對照組，重癥組IL-13-1112 C/T位點CC基因型分布頻率高于普通組，差異有顯著性，提示人群中該位點變異等位基因C為主要攜帶基因且攜帶者更容易罹患重型EV71型HFMD。IL-4-590和IL-13-1112基因多態(tài)性的聯(lián)合研究為進一步明確 HFMD發(fā)病機制提供了線索，也為臨床篩選重癥病兒提供了新的依據(jù)。

綜上所述，IL-4-590 位點T等位基因及IL-13-1112位點C等位基因頻率明顯高于正常對照組，提示其可能與 EV71 感染易感性有關，而IL-13-1112位點C等位基因的攜帶可能對重癥EV71感染易感。本研究為臨床EV71感染的早期診斷及治療開辟新的途徑。臨床上遇到HFMD病兒，可早期篩查IL-13-1112 C位點，結合臨床癥狀，早期篩查出重癥病兒，以期達到早期治療，改善預后。但同時本研究也存在一定的局限性，如目前對IL-4-590 C/T位點、IL-13-1112 C/T位點基因多態(tài)性在EV71型HFMD病兒中的發(fā)病機制，及它們之間是否相互影響的認識還不夠全面，需擴大樣本量進行深入驗證，從而為揭示宿主基因多態(tài)性在疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用提供依據(jù)，指導臨床治療。

[參考文獻]

[1]ZHANG Mingzhi， LU Yong， ZHANG Xiaobo， et al. Interleukin-4 polymorphism is associated with severity of respiratory syncytial virus infection[J]. Journal of Paediatrics and Child Health， 2016，52（1）：25-29.

[2]SOOSANABADI M， BAYAT H， KAMALI K， et al. Asso-ciation study of IL-4-590 C/T and DDX39B-22 G/C polymorphisms with the risk of late-onset Alzheimer’s disease in ira-nian population[J]. Current Aging Science， 2015，8（3）：276-281.

[3]CHEN Lei， SHEN Yongchun， LIU Lian， et al. Interleukin-13-1112 C/T promoter polymorphism confers risk for COPD： a Meta-analysis[J]. PLoS One， 2013，8（7）：e68222.

[4]NEDOSZYTKO B， OLSZEWSKA B， ROSZKIEWICZ J， et al. The role of polymorphism of interleukin-2，-10，-13 and TNF-α genes in cutaneous T-cell lymphoma pathogenesis[J]. Postepy Dermatologii Alergologii， 2016，33（6）：429-434.

[5]《手足口病診療指南（2018版）》編寫專家委員會. 手足口病診療指南（2018年版）[J]. 中華傳染病雜志， 2018，36（5）：257-263.

[6]ZHANG Shuyan， XU Meiyan， XU Hongmei， et al. Immunologic characterization of cytokine responses to enterovirus 71 and coxsackievirus a16 infection in children[J]. Medicine， 2015，94（27）：e1137.

[7]FU Yuxuan， ZHANG Li， ZHANG Fang， et al. Exosome-mediated miR-146a transfer suppresses type Ⅰ interferon response and facilitates EV71 infection[J]. PLoS Pathogens， 2017，13（9）：e1006611.

[8]WANG Wenbiao， XIAO Feng， WAN Pin， et al. EV71 3D protein binds with NLRP3 and enhances the assembly of inflammasome complex[J]. PLoS Pathogens， 2017，13（1）：e1006123.

[9]CHANG Zhangmei， WANG Yan， BIAN Liang， et al. Enterovirus 71 antagonizes the antiviral activity of host STAT3 and IL-6R with partial dependence on virus-induced miR-124[J]. Journal of General Virology， 2017，98（12）：3008-3025.

[10]LI Zheng， WANG Hongbin， CHEN Yihui， et al.Interleukin-18 protects mice from Enterovirus 71 infection[J]. Cytokine， 2017，96：132-137.

[11]LIN Y L， CHENG P Y， CHIN C L， et al. Fibroblast-stimulating lipopeptide-1 as a potential mucosal adjuvant enhances mucosal and systemic immune responses to enterovirus 71 vaccine[J]. Vaccine， 2018，36（29）：4331-4338.

[12]JIN Yuefei， ZHANG Chao， WANG Hui， et al. Mast cells contribute to Enterovirus 71 infection-induced pulmonary edema in neonatal mice[J]. Laboratory Investigation， 2018，98（8）：1039-1051.

[13]CAO Li， ZHANG Xinyan，YUAN Sumei， et al. Autophagy induced by enterovirus 71 regulates the production of IL-6 through the p38MAPK and ERK signaling pathways[J]. Microbial pathogenesis， 2019，131：120-127.

[14]ZHANG Yuhong， SUO Xiaoying， ZHANG Yufang. Association of IL-13， S100B， and TLR-7 gene polymorphisms with enterovirus 71 infection in hand， foot， and mouth disease in China[J]. Genetic testing and molecular biomarkers， 2019，23（3）：188-196.

[15]SHAO Ping， WU Xiaoxin， LI Hongbo， et al. Clinical significance of inflammatory cytokine and chemokine expression in hand， foot and mouth disease[J]. Molecular Medicine Reports， 2017，15（5）：2859-2866.

[16]LEE J Y， SON M， KANG J H， et al. Serum interleukin-6 le-vels as an indicator of aseptic meningitis among children with enterovirus 71-induced hand， foot and mouth disease[J]. Postgraduate Medicine， 2018，130（2）：258-263.

[17]YU Pin， BAO Linlin， XU Lili， et al. Neurotropism in vitro and mouse models of severe and mild infection with clinical strains of enterovirus 71[J]. Viruses， 2017，9（11）：e351.

[18]HUANG Qian， WANG Yanhua， SI Changyun， et al. Interleukin-35 modulates the imbalance between regulatory T cells and T helper 17 cells in enterovirus 71-induced hand，foot，and mouth disease[J]. J Interferon Cytokine Res， 2017，37（12）：522-530.

[19]SHANG Wenzhong， QIAN Suying， FANG Lijuan， et al. Association study of inflammatory cytokine and chemokine expression in hand foot and mouth disease[J]. Oncotarget， 2017，8（45）：79425-79432.

[20]ZHAO Na， CHEN Huilan， CHEN Zhenzhen， et al. IL-10-592 polymorphism is associated with IL-10 expression and severity of enterovirus 71 infection in Chinese children[J]. Journal of Clinical Virology， 2017，95：42-46.

[21]LI Fei， LIU Peipei， GUO Ya， et al. Association of Interleukin-17F gene polymorphisms with susceptibility to severe enterovirus 71 infection in Chinese children[J]. Archives of viro-logy， 2018，163（7）：1933-1939.

[22]LI Fei， LIU Xiangping， LI Jian， et al. Correlation of an interleukin-4 gene polymorphism with susceptibility to severe enterovirus 71 infection in Chinese children[J]. Archives of Virology， 2015，160（4）：1035-1042.

[23]GU Jianzhong， SHEN Yingying， ZHANG Yongjun. Association between interleukin-4 polymorphisms and environment and nonsmall cell lung cancer in Chinese population[J]. Journal of Cancer Research and Therapeutics， 2014，10（Suppl）： C135-C139.

[24]YAN Yan， WENG Hong， SHEN Zhenghai， et al. Association between interleukin-4 gene-590 c/t，-33 c/t， and 70-base-pair polymorphisms and periodontitis susceptibility： a meta-analy-sis[J]. Journal of Periodontology， 2014，85（11）：e354-e362.

[25]HUSSEIN Y M， SHALABY S M， NASSAR A A， et al. Association between genes encoding components of the IL-4/IL-4 receptor pathway and dermatitis in children[J]. Gene， 2014，545（2）：276-281.

[26]LI Xiang， CHAI Wei， NI Ming， et al. The effects of gene po-lymorphisms in interleukin-4 and interleukin-6 on the susceptibility of rheumatoid arthritis in a Chinese population[J]. BioMed Research International， 2014（350）：265435.

[27]VAFA M， ISRAELSSON E， BAKARY M， et al. Impact of the IL-4-590 C/T transition on the levels of plasmodium falciparum specific IgE， IgG， IgG subclasses and total IgE in two sympatric ethnic groups living in Mali[J]. Scandinavian Journal of Immunology， 2008，68（2）：254-255.

[28]CHEN Zhifeng， LI Ruiqin， XIE Zhichao， et al. IL-6，IL-10 and IL-13 are associated with pathogenesis in children with Enterovirus 71 infection[J]. International Journal of Cli-nical and Experimental Medicine， 2014，7（9）：2718-2723.

[29]TSOU Y L， LIN Y W， SHAO H Y， et al. Recombinant adeno-vaccine expressing enterovirus 71-like particles against hand， foot， and mouth disease[J]. PLoS Neglected Tropical Diseases， 2015，9（4）：e0003692.

[30]ZHANG Wenbo， XU Pu， CHEN Zhuogeng， et al. IL-13-1112 polymorphism and periodontitis susceptibility： a meta-analysis[J]. BMC Oral Health， 2018，18（1）：21-29.

[31]WALCZAK A， PRZYBYLOWSKA K， DZIKI L， et al. The IL-8 and IL-13 gene polymorphisms in inflammatory bowel disease and colorectal cancer[J]. DNA and Cell Biology， 2012，31（8）：1431-1438.

[32]ALSAID A， EL-MISSIRY M， HATATA E S， et al. Association of IL-4-590 C>T and IL-13-1112 C>T gene polymorphisms with the susceptibility to type 2 diabetes mellitus[J]. Disease Markers， 2013，35（4）：243-247.

（本文編輯 于國藝）