肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

王延濤 楊智華 陳怡 麥喆钘 黃嘉華 孫治中 周馳 李偉寬

中圖分類號(hào) R932；R966 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）05-0645-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.14

摘 要 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。方法：通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）獲取肉蓯蓉的活性成分，采用反向分子對(duì)接服務(wù)器DRAR-CPI及相關(guān)數(shù)據(jù)庫GeneCards、OMIM篩選肉蓯蓉活性成分治療骨質(zhì)疏松的作用靶標(biāo)；采用軟件Cytoscape構(gòu)建肉蓯蓉的“成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫String和Cytoscape繪制靶標(biāo)間相互作用關(guān)系；通過服務(wù)器Systems Dock WebSite將靶標(biāo)與活性成分進(jìn)行分子對(duì)接評(píng)估二者間的結(jié)合活性以進(jìn)行驗(yàn)證；最后再利用數(shù)據(jù)庫DAVID對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行基因本體分類富集分析與京都基因與基因組百科全書通路富集分析。結(jié)果：從肉蓯蓉中篩選出的活性成分有13個(gè)，主要為毛蕊花糖苷、益母草堿、京尼平酸等；活性成分作用的潛在靶標(biāo)有43個(gè)，主要有成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄分子2（RUNX2）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、骨生長蛋白因子（BGP）、腫瘤壞死因子（TNF）等；靶標(biāo)作用涉及的信號(hào)通路有多條，主要為WNT（Wingless/Integrated）、VEGF、TNF等。結(jié)論：本研究初步探討并驗(yàn)證了肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的主要靶標(biāo)和通路，為后續(xù)進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 肉蓯蓉；骨質(zhì)疏松；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；活性成分；靶標(biāo)；分子對(duì)接；信號(hào)通路

Network Pharmacology Exploration of the Mechanism of Cistanche deserticola in the Treatment of Osteoporosis

WANG Yantao1，YANG Zhihua2，CHEN Yi3，MAI Zhexing2，HUANG Jiahua3，SUN Zhizhong3，ZHOU Chi4，LI Weikuan1（1.General Department， Guangzhou Panyu District Hospital of TCM， Guangzhou 511400， China； 2.Second Clinical Medical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China；3.First Clinical Medical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China；4.Hip Protection Ward， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510115， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of Cistanche deserticola in the treatment of osteoporosis by network pharmacology. METHODS： The active components of C. deserticola were retrieved and obtained by TCM system platform （TCMSP）. Reverse molecular docking server DRAR-CPI and related databases GeneCards and OMIM were used to screen the target of C. deserticola active ingredients in the treatment of osteoporosis. The “component-target”network of C. deserticola was constructed by Cytoscape software， and the interaction between targets was plotted by String database and Cytoscape software. The combination activity of target and active ingredient was evaluated via molecular docking with Systems Dock WebSite server. GO classification and enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were conducted for target genes using DAVID database. RESULTS： Totally 13 active ingredients were screened out from C. deserticola， such as verbascoside， leonurine， geniposidic acid. There were 43 active ingredient-treated potential targets， such as RUNX2， VEGF， IL-6， BGP， TNF. Multiple signaling pathways were involved in target action， such as WNT （Wingless/Integrated）， VEGF， TNF. CONCLUSIONS： This study preliminarily explores and validates the main targets and pathways of C. deserticola in the treatment of osteoporosis， which lay the foundation for further study of its mechanism.

KEYWORDS Cistanche deserticola； Osteoporosis； Network pharmacology； Active ingredients； Target； Molecular docking； Signaling pathways

骨質(zhì)疏松（Osteoporosis，OP）是一種好發(fā)于中老年人的系統(tǒng)性、慢性疾病，以骨密度下降和骨的顯微結(jié)構(gòu)破壞為主要特征。因患者的骨質(zhì)脆性增加，其發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，輕微的外傷即可導(dǎo)致骨折[1-2]。骨質(zhì)疏松及其嚴(yán)重的并發(fā)癥，給患者及其家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)也嚴(yán)重地影響著患者的生活質(zhì)量[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國老年人口總數(shù)已占總?cè)丝跀?shù)的13.26%[4]。因此，探究療效更好、更安全的治療骨質(zhì)疏松的方法顯得非常必要。目前對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療主要采取藥物治療，包括以化學(xué)藥為主的骨吸收抑制藥、骨形成制劑、鈣劑和維生素D等[5]。另外，中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松的報(bào)道也較多，其中尤以肉蓯蓉為主要組方藥材[6-9]。

肉蓯蓉味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便的功效，常常用于治療由腎陽虧虛、精血不足所引起的病證[10]。近來，也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠有保護(hù)作用[11]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，肉蓯蓉可以提高骨質(zhì)疏松模型大鼠血清堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素及鈣離子水平，促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞骨形成蛋白2（BMP2）的表達(dá)，加快骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，促使大鼠成骨細(xì)胞合成ALP等，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的作用[12-14]。但目前對(duì)于肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制研究尚停留在單項(xiàng)的細(xì)胞試驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上，難以詳細(xì)地探究其更全面的作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多個(gè)學(xué)科的技術(shù)和知識(shí)為基礎(chǔ)，可多層次、全面地闡明藥物治療疾病的作用機(jī)制，使研究更能體現(xiàn)整體性和系統(tǒng)性[15]。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)從多靶標(biāo)、多途徑進(jìn)行分析，這與中藥及其復(fù)方中多成分、多靶標(biāo)治療疾病的特點(diǎn)不謀而合[16]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，研究分析肉蓯蓉的化學(xué)成分、作用靶標(biāo)以及信號(hào)通路，并進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）分類富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，通過構(gòu)建肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，從整體性角度揭示肉蓯蓉多靶標(biāo)、多通路的作用網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步探究其治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 資料

本研究使用的數(shù)據(jù)庫及相關(guān)分析平臺(tái)見表1。

2 方法

2.1 化學(xué)成分的獲取與活性成分的篩選

于TCMSP 中以“肉蓯蓉”作為關(guān)鍵詞，搜索獲取肉蓯蓉所含的所有化學(xué)成分信息。以口服利用度（OB）大于30%、類藥性（DL）大于0.18作為限定條件[17]，篩選同時(shí)符合上述2個(gè)條件的成分作為活性成分。利用Pubchem檢索上述活性成分，得到各成分的3D結(jié)構(gòu)并以mol2格式保存。

2.2 活性成分作用靶標(biāo)及骨質(zhì)疏松作用靶標(biāo)的獲取

本研究利用基于蛋白-配體相互作用親合性函數(shù)的DRAR-CPI，使用該服務(wù)器通過分子對(duì)接預(yù)測(cè)各成分可能對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，并依據(jù)對(duì)接的緊密性進(jìn)行打分[18]。具體操作如下：將“2.1”項(xiàng)檢索所得肉蓯蓉所有活性成分的mol2格式文件上傳至DRAR-CPI ，選取Z-score<-0.5[19]的靶點(diǎn)作為肉蓯蓉活性成分的潛在靶點(diǎn)。利用 UniProt知識(shí)庫的 UniProt Knowledgebase搜索功能，導(dǎo)入肉蓯蓉作用的蛋白靶點(diǎn)的靶蛋白編號(hào)（PBD ID），限定物種為“人”，經(jīng)過檢索和轉(zhuǎn)化操作，得到肉蓯蓉活性成分的相應(yīng)靶標(biāo)。

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫，以“Osteoporosis”或“OP”作為關(guān)鍵詞檢索，在數(shù)據(jù)庫中收集與骨質(zhì)疏松相關(guān)的靶標(biāo)。將所得靶標(biāo)與肉蓯蓉活性成分的靶標(biāo)進(jìn)行對(duì)比，以此篩選出共同的靶標(biāo)。

2.3 “成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將“2.1”項(xiàng)得到的肉蓯蓉的活性成分和“2.2”項(xiàng)收集的治療骨質(zhì)疏松的靶標(biāo)導(dǎo)入 Cytoscape 軟件中，構(gòu)建肉蓯蓉的“成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)。

2.4 靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)之間及與預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的搜索[20]。將肉蓯蓉的蛋白靶標(biāo)導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“人”，獲取肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的潛在靶標(biāo)間的相互關(guān)系。利用Cytoscape 軟件，繪制蛋白相互作用網(wǎng)路，用Cytoscape的工具NetworkAnalyzer進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，將節(jié)點(diǎn)大小和顏色設(shè)置為用于反映 Degree（連接度，即在網(wǎng)絡(luò)中通過該點(diǎn)的邊的個(gè)數(shù)）值的大小，邊的粗細(xì)設(shè)置為用于反映結(jié)合分?jǐn)?shù)的大小，最終獲得靶標(biāo)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2.5 分子對(duì)接

利用Systems Dock WebSite 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)和分析，研究配體對(duì)復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)的作用。該服務(wù)器主要通過Dock-In評(píng)分（平臺(tái)內(nèi)置評(píng)分功能）的分子對(duì)接功能評(píng)估蛋白-配體結(jié)合活性[21]，故可利用其得到相互作用網(wǎng)絡(luò)中的Degree值，對(duì)Degree值排名前5的分子與肉蓯蓉的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。之后保存分子對(duì)接結(jié)果，并對(duì)其進(jìn)行Docking Score 評(píng)分，用以評(píng)價(jià)肉蓯蓉活性成分與靶標(biāo)之間的結(jié)合活性。

2.6 生物過程與通路分析

利用DAVID為大規(guī)模的基因或蛋白提供系統(tǒng)而綜合的生物功能注釋信息的功能，獲取最顯著富集的生物學(xué)注釋[22]。即在DAVID中，對(duì)肉蓯蓉的作用靶標(biāo)進(jìn)行 GO通路和KEGG 通路富集分析，保存結(jié)果。其中，GO通路富集分析可分為細(xì)胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）和生物過程（Biological process，BP）3部分。設(shè)定閾值 P<0.05，并按照涉及的靶標(biāo)數(shù)目多少進(jìn)行排序，篩選前20名的生物過程或通路，利用GraphPad Prism 繪制GO通路分析與KEGG通路分析圖。

2.7 “成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分析“2.6”項(xiàng)中排名前20的作用靶標(biāo)的KEGG通路，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出可能與治療骨質(zhì)疏松密切相關(guān)的通路，獲取富集在這些通路上的肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的潛在靶標(biāo)，并與相應(yīng)的活性成分相對(duì)應(yīng)，構(gòu)建肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的“成分-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

3 結(jié)果

3.1 肉蓯蓉活性成分分析

在TSCMP數(shù)據(jù)庫中，以O(shè)B值大于30%、DL值大于0.18為篩選條件，收集肉蓯蓉的活性成分，其中符合條件的活性成分共有13個(gè)，包括益母草堿、右旋喇叭茶醇、去咖啡酰基類葉升麻苷、京尼平酸等。另外，本研究還選擇了部分OB值低于30%，但含量較高，具有較高藥理研究價(jià)值的活性成分，如橙花醛、蝙蝠葛堿、毛蕊花糖苷等。

3.2 潛在靶標(biāo)預(yù)測(cè)

在服務(wù)器DRAR-CPI中檢索肉蓯蓉13個(gè)活性分子對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)，共得到258個(gè)，去除重復(fù)靶標(biāo)后，共得137個(gè)潛在靶標(biāo)。通過與GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中與骨質(zhì)疏松相關(guān)靶標(biāo)的對(duì)比，篩選出抗骨質(zhì)疏松的可能潛在靶標(biāo)43個(gè)，其主要是成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄分子2（RUNX2）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、骨生長蛋白因子（BGP）等。

3.3 “成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過將肉蓯蓉活性成分和潛在靶標(biāo)的相關(guān)信息輸入軟件Cytoscape中，構(gòu)建肉蓯蓉的“成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

在圖1中，共含有節(jié)點(diǎn)56個(gè)，邊線185條。六邊形節(jié)點(diǎn)即代表肉蓯蓉活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在的靶標(biāo)。邊線代表活性成分與潛在靶標(biāo)的相互關(guān)聯(lián)。由此圖可知，同一活性成分可以作用于不同靶標(biāo)，同一靶標(biāo)也可對(duì)應(yīng)不同活性成分，體現(xiàn)出肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

3.4 靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過數(shù)據(jù)庫String獲取肉蓯蓉活性分子與骨質(zhì)疏松相關(guān)靶標(biāo)的相互關(guān)系，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件Cytoscape中構(gòu)建靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

由圖2可知，靶標(biāo)間相互作用網(wǎng)絡(luò)中包含節(jié)點(diǎn)59個(gè)，邊線453條。其中圓形節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)，邊線代表靶標(biāo)之間的相關(guān)性，節(jié)點(diǎn)的面積大小表示靶標(biāo)的Degree值大小，節(jié)點(diǎn)面積越大，顏色越深，表示其Degree值越大。通過比較Degree值的大小，并結(jié)合現(xiàn)有的研究結(jié)果，推測(cè)肉蓯蓉抗骨質(zhì)疏松與RUNX2、VEGF、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）、BGP 這5個(gè)靶標(biāo)有關(guān)。

3.5 分子對(duì)接

選取靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)中Degree值最大的5個(gè)靶標(biāo)即RUNX2、VEGF、IL-6、TNF、BGP，將其名稱輸入軟件System Dock WebSite，并與肉蓯蓉的13個(gè)活性分子進(jìn)行分子對(duì)接，5個(gè)靶標(biāo)Docking Score值-活性成分?jǐn)?shù)量結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在肉蓯蓉13個(gè)活性分子與5個(gè)靶標(biāo)的對(duì)接中，共有6個(gè)（占9%）的Docking Score值大于7，36個(gè)（占55%）的Docking Score值在5.0～7.0之間，18個(gè)（占28%）的Docking Score值在4.25～5.0之間，5個(gè)（占8%）的Docking Score值小于4.25。一般認(rèn)為，Docking Score值大于4.25表示分子與靶標(biāo)具有一定的結(jié)合能力，大于5.0表示結(jié)合能力較強(qiáng)，大于7.0表示結(jié)合能力很強(qiáng)[23]。因此，肉蓯蓉的活性成分與靶標(biāo)之間具有良好的結(jié)合能力。

3.6 GO分類富集分析和KEGG通路富集分析

對(duì)肉蓯蓉活性分子的對(duì)應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行GO分類富集分析和KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選條件，篩選出富集基因數(shù)量較大的通路和生物過程。CC分析結(jié)果見圖4，MF分析見圖5，BP分析見圖6，KEGG通路富集分析結(jié)果見圖7。

由圖4～圖6可見，在CC分析結(jié)果中，富集基因數(shù)量較大的有內(nèi)涵體通路、頂端質(zhì)膜通路、膜筏通路、髓鞘通路等；在MF分析結(jié)果中，富集基因數(shù)量較大的有蛋白酪氨激酶活性通路、肝素結(jié)合通路、細(xì)胞因子活性通路、蛋白結(jié)合通路等；在BP分析結(jié)果中，富集基因數(shù)量較大的有內(nèi)皮細(xì)胞遷移負(fù)調(diào)控通路、一氧化氮介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、血管收縮調(diào)節(jié)通路、鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)通路等。由圖7可見，在KEGG通路富集分析結(jié)果中，WNT（Wingless/Integrated）信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）受體活化因子（RANK）信號(hào)通路、叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FoxO） 信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP） 信號(hào)通路等與肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的潛在靶標(biāo)的相關(guān)性明顯。

3.7 “成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

綜合GO通路和KEGG通路富集分析的結(jié)果，篩選出可能具有抗骨質(zhì)疏松作用的通路，并將其與肉蓯蓉的活性分子和相應(yīng)的潛在靶標(biāo)一一對(duì)應(yīng)，即活性分子與靶標(biāo)對(duì)應(yīng)，靶標(biāo)與可能通路對(duì)應(yīng)，從而構(gòu)建出肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖8。

如圖8所示，肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的活性成分主要有益母草堿、毛蕊花糖苷、去咖啡?；惾~升麻苷、京尼平酸等8個(gè)，這些活性成分作用的靶標(biāo)有RUNX2、IL-6、BGP、TNF、VEGF、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、過氧化物酶增殖激活受體（PPAR）-γ等32個(gè)，這些靶標(biāo)主要被包含在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、VEGF、WNT、TNF等7條信號(hào)通路中。

4 討論

4.1 肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松的文獻(xiàn)來源

肉蓯蓉是寄生在沙漠樹木梭梭根部的列當(dāng)科寄生植物，具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便之功效[24]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)輯注》[25]中提到肉蓯蓉“主五勞七傷，補(bǔ)中，除莖中寒熱痛，養(yǎng)五臟，強(qiáng)陰，益精氣，婦人癥瘕”；相關(guān)研究表明[26]，肉蓯蓉可降低相關(guān)因子的陽性表達(dá)，具有一定的抗骨質(zhì)疏松作用，但與其相關(guān)的機(jī)制仍待研究。因此，研究肉蓯蓉抗骨質(zhì)疏松的分子作用機(jī)制有較大的意義。

4.2 主要活性成分分析

本次研究收集到肉蓯蓉中具有抗骨質(zhì)疏松的化學(xué)成分主要有毛蕊花糖苷、益母草堿、京尼平酸等。研究表明，肉蓯蓉中的毛蕊花糖苷可以作為抗再吸收劑，通過阻斷破骨細(xì)胞活化來減少骨質(zhì)流失[27]。肉蓯蓉中的益母草苷堿可通過抑制NF-κB和磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞生成并預(yù)防與雌激素缺乏相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥[28]。京尼平酸參與激活成骨細(xì)胞促進(jìn)骨生成的相關(guān)步驟，并抑制破骨細(xì)胞活性以抑制骨質(zhì)溶解[29]。

4.3 主要靶標(biāo)分析

本次研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉可通過對(duì)BGP、TNF、CTGF、PPAR-γ等靶標(biāo)進(jìn)行作用來達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的作用。多項(xiàng)研究顯示，BGP可影響骨代謝、促進(jìn)骨吸收，從而對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)生產(chǎn)生影響[30]； TNF-α通過激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)而協(xié)同促進(jìn)RANK配體（RANKL）誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。此外，CTGF表達(dá)的下降可促進(jìn)人骨成形蛋白2（BMP-2）誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化，CTGF的表達(dá)與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化有密切關(guān)系[31]。PPAR-γ作為PPAR基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，與PPAR-β /δ不同，其可減少骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的增加破骨細(xì)胞生成等作用[32]。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)肉蓯蓉可能通過提高體內(nèi)TNF、BGP、ALP的水平或上調(diào)CTGF、PPAR-γ的表達(dá)來發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

4.4 主要通路分析

本次研究結(jié)果顯示，與肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松相關(guān)的通路有WNT、VEGF、IL-6等。其中，WNT通路的表達(dá)可增加成骨細(xì)胞的成骨活性和礦化能力[33]，且另有相關(guān)的基礎(chǔ)研究證實(shí)[34]，WNT可促進(jìn)β-連環(huán)蛋白結(jié)合Lef1/Tcf轉(zhuǎn)錄因子，并改變基因表達(dá)以促進(jìn)成骨細(xì)胞的擴(kuò)增和功能。間充質(zhì)干細(xì)胞中VEGF的表達(dá)升高會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞增加和脂肪細(xì)胞分化的減少，并調(diào)節(jié)二者之間的均衡比例[35]。RUNX2是成骨細(xì)胞分化和骨形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，對(duì)MSCs成骨細(xì)胞譜系有著重大的作用[36]。而IL-6的表達(dá)可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化、增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性[37]，可顯著促進(jìn)人成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖，以及人內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[38]。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，分析肉蓯蓉在抗骨質(zhì)疏松治療方面的有效活性成分和分子機(jī)制，結(jié)果顯示肉蓯蓉中具有治療骨質(zhì)疏松作用的化學(xué)成分可能是毛蕊花糖苷、益母草堿、京尼平酸等。此成分可能通過BGP、TNF、CTGF、PPAR-γ等靶標(biāo)及WNT、VEGF、IL-6等信號(hào)通路發(fā)揮活性作用。另外，通過相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，可直觀地顯示出肉蓯蓉治療骨質(zhì)疏松具有多成分、多途徑共同作用的特點(diǎn)，符合中醫(yī)藥治療疾病的特色，相比化學(xué)藥的單基因-單靶點(diǎn)的作用機(jī)制，更有優(yōu)勢(shì)。且本研究通過分子對(duì)接驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性，但需要注意的是，本研究結(jié)果只是一種分子機(jī)制上的預(yù)測(cè)探討，藥物具體作用機(jī)制的確認(rèn)仍需通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

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（收稿日期：2018-10-09 修回日期：2018-12-19）

（編輯：劉 萍）