崔嘉晗　趙明　牛海濤　王新生

[摘要]目的探討生物信息學(xué)分析對(duì)乳頭狀腎細(xì)胞癌（PRCC）差異表達(dá)基因和通路的意義。方法分析癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中PRCC的RNA測序數(shù)據(jù)，應(yīng)用生物信息學(xué)分析篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)候選基因依據(jù)功能和信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。結(jié)果 分析TCGA中PRCC和癌旁正常組織的RNA測序數(shù)據(jù)，篩選4 639個(gè)差異表達(dá)的基因。對(duì)篩選差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體及代謝通路富集分析后得到818個(gè)基因本體術(shù)語（GO terms）和110條信號(hào)通路術(shù)語（pathway terms）。結(jié)論 運(yùn)用edgeR包以及基因本體及信號(hào)通路分析，篩選了PRCC與癌旁正常組織差異表達(dá)基因及富集的信號(hào)通路。

[關(guān)鍵詞]癌，腎細(xì)胞;基因本體;信號(hào)通路;遺傳關(guān)聯(lián)研究;計(jì)算生物學(xué)

[中圖分類號(hào)]R730.26[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)] 2096-5532（2019）04-0402-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the significance of bioinformatics in the analysis of differentially expressed genes and pathways in papillary renal cell carcinoma （PRCC）.MethodsThe RNA sequencing data of PRCC in the Cancer Genome Atlas database （TCGA） were analyzed. Differentially expressed genes were identified by bioinformatics analysis， and candidate genes were then enriched according to their functions and the signaling pathways in which they were involved.ResultsRNA sequencing data of PRCC and adjacent normal tissues in TCGA were analyzed and 4639 differentially expressed genes were screened out. After enrichment analyses of gene ontology and metabolic pathways for these differentially expressed genes，818 gene ontology terms and 110 pathway terms were obtained.ConclusionUsing the edgeR package and gene ontology and pathway analyses， the differentially expressed genes and enriched signaling pathways between PRCC and adjacent normal tissues were screened out.

[KEY WORDS]carcinoma， renal cell; gene ontology; signaling pathway; genetic association studies; computational biology

腎細(xì)胞癌（RCC）是最常見的腎臟癌癥，占所有成人惡性腫瘤的2%～3%[1-2]。有20%～30%的病人被診斷為RCC時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，另有20%的病人接受腎切除術(shù)后會(huì)復(fù)發(fā)并發(fā)展成為轉(zhuǎn)移性RCC [3-4]。轉(zhuǎn)移性RCC病人生存率低，預(yù)后極差[5-6]。乳頭狀腎細(xì)胞癌（PRCC）是第二常見的RCC類型，占所有RCC的10%～20%[1]。PRCC可根據(jù)組織病理學(xué)特征進(jìn)一步分為兩種主要亞型[7-9]。癌癥基因組圖譜（TCGA）是臨床信息和基因測序數(shù)據(jù)的大型綜合集合。既往RCC研究主要以透明細(xì)胞RCC為主，缺乏PRCC相關(guān)研究。為了探究PRCC涉及的信號(hào)傳導(dǎo)途徑和驅(qū)動(dòng)基因并且進(jìn)行系統(tǒng)分析，本文利用TCGA進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，篩選PRCC中差異表達(dá)基因及富集的信號(hào)通路?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)樣本信息收集

于 TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）中收集與PRCC相關(guān)的RNA的測序數(shù)據(jù)（Level3），包括289例PRCC組織和32例癌旁非癌腎組織。

1.2篩選PRCC中異常表達(dá)的mRNAs

利用genecode數(shù)據(jù)庫篩選mRNA測序數(shù)據(jù)，共涵蓋20 271個(gè)mRNA數(shù)據(jù)。隨后以R語言包edgeR計(jì)算異常表達(dá)的mRNAs（差異倍數(shù)>2并且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）校正后P值<0.01）。排除超過75%的樣品中表達(dá)<2的mRNA。

1.3基因本體分析和富集途徑分析

使用在線數(shù)據(jù)庫DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行差異基因的基因本體分析和富集途徑分析。基因本體分析和富集途徑分析均以P值<0.05作為臨界標(biāo)準(zhǔn)。

1.4基因集富集分析

基因組富集分析使用Java GSEA軟件?；蚪M富集分析軟件及注釋基因集均由Broad研究所網(wǎng)站（http：//www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）下載?；蚣疨<0.05并且FDR<0.25被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用R語言（版本號(hào)3.5.1）中的edgeR包篩選PRCC和癌旁正常組織中不同表達(dá)的基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR校正后P值<0.01和差異倍數(shù)>2的基因。對(duì)于GO和KEGG途徑分析，其中P<0.05的GO術(shù)語或途徑是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的。

2結(jié)果

2.1癌與癌旁配對(duì)樣本差異表達(dá)的mRNA

對(duì)PRCC標(biāo)本及癌旁正常組織的mRNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析（差異倍數(shù)>2并且FDR校正后P值<0.01），篩選4 639個(gè)差異表達(dá)的基因，在樣品中2 638個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄物被上調(diào)并且2 001個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄物被下調(diào)?；鹕綀D見圖1。其中，PRCC及其癌旁正常組織中50種最具有表達(dá)差異的mRNA（從倍數(shù)變化最大到最小列出）見表1。

利用在線基因功能分類工具（https：//david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp），基于功能相似性對(duì)篩選出的50種最具有表達(dá)差異的基因進(jìn)行分組。上調(diào)組篩選出1個(gè)功能相關(guān)基因組，基因?yàn)镾IGLEC8、CNTN6、VSTM2A、VSTM2L。下調(diào)組篩選出2個(gè)功能相關(guān)基因組，其中一個(gè)基因組為SLC34A3、SCNN1B、SLC22A8、SLC9A4、SLC12A1，另外一個(gè)基因組為AQP2、MUC15、SLC22A8、SLC14A2。檢索相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)SIGLEC8表達(dá)的增強(qiáng)預(yù)測了PRCC病人的不良預(yù)后[10]。另外，MUC15在PRCC中的表達(dá)降低[11]，但是其余大部分基因在PRCC中的作用仍不明確。

2.2差異表達(dá)基因的基因本體分析

利用在線數(shù)據(jù)庫DAVID分析差異表達(dá)基因，以P<0.05作為臨界標(biāo)準(zhǔn)。基因本體分析分為3個(gè)功能組：分子功能組、生物過程組和細(xì)胞成分組。在生物過程組中，上調(diào)的基因主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，下調(diào)基因主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附等。在細(xì)胞成分組中，上調(diào)基因主要富集在膜的組成部分、質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)域等，下調(diào)基因主要富集于膜的組成部分、質(zhì)膜等。在分子功能組中，上調(diào)基因主要富集于鈣離子結(jié)合、受體結(jié)合等，下調(diào)基因主要富集于鈣離子結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性等。其中，PRCC標(biāo)本轉(zhuǎn)錄組上調(diào)基因最顯著富集的5個(gè)基因本體術(shù)語見圖2A～C，下調(diào)基因最顯著富集的5個(gè)基因本體術(shù)語見圖2D～F。

2.3信號(hào)通路富集分析

使用KEGG PATHWAY在線網(wǎng)站進(jìn)行差異基因的功能和信號(hào)傳導(dǎo)途徑富集。上調(diào)的基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等，下調(diào)的基因主要富集于代謝途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、癌癥的途徑等。見圖2G、H。

2.4基因集富集分析

基因集富集分析通過關(guān)注具有共同生物功能、染色體定位或調(diào)節(jié)的基因組，從而篩選出可能與疾病表型相關(guān)的過量表達(dá)的基因或蛋白質(zhì)。我們使用KEGG基因組作為基因集對(duì)PRCC及其癌旁正常組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析。確定了7個(gè)上調(diào)途徑以及12個(gè)下調(diào)途徑。見圖3A、B。

3討論

在過去的幾十年中，已經(jīng)進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)和臨床研究，揭示PRCC形成和發(fā)展的原因和潛在機(jī)制[12-15]。已報(bào)道PRCC具有代表性遺傳基因突變和失調(diào)的途徑包括：MET基因突變、HIPPO途徑、NRF2途徑、染色質(zhì)修飾基因突變等[9]。本研究應(yīng)用生物信息分析技術(shù)深入分析TCGA數(shù)據(jù)集，并在第一步中確定了4 639個(gè)差異表達(dá)的基因（2 638個(gè)上調(diào)和2 001個(gè)下調(diào)）。在第二步中，對(duì)篩選差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體分析及代謝通路分析，本研究中篩選的上調(diào)基因主要富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、膜的組成部分和鈣離子結(jié)合等途徑中;下調(diào)基因主要富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、膜的組成部分和鈣離子結(jié)合等途徑中。改變的基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為理解PRCC的分子基礎(chǔ)提供相關(guān)數(shù)據(jù)，從細(xì)胞通路及代謝途徑更好揭示PRCC內(nèi)在分子機(jī)制，探究預(yù)后的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。既往研究已提示上皮細(xì)胞黏附及其活化分子在高級(jí)別RCC中的過度表達(dá)可能是預(yù)后的有用標(biāo)志[16]。在PRCC發(fā)生骨轉(zhuǎn)移病人的組織樣本和原代細(xì)胞中，檢測到鈣離子受體表達(dá)明顯增強(qiáng)[17-18]。本研究中，同樣觀察到鈣離子結(jié)合途徑發(fā)生明顯改變，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符合。以前研究表明，腫瘤的發(fā)生與炎癥狀態(tài)有密切關(guān)系[19]，這與本研究顯示免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)相關(guān)基因集在PRCC上調(diào)具有一致性。此外，既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤可建立腫瘤內(nèi)免疫抑制環(huán)境，以支持其生長并促進(jìn)免疫逃避[20-21]，本研究結(jié)果同樣顯示腫瘤內(nèi)免疫反應(yīng)的改變。腫瘤內(nèi)的代謝物水平的增加可以促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展，可導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)、酶活性或代謝通量的改變[22]。散發(fā)性和家族性2型PRCC檢測到增強(qiáng)的有氧糖酵解，并且具有抗氧化反應(yīng)的細(xì)胞表型[23-24]。

本研究第三步中，利用基因集富集分析方法分析篩選的差異表達(dá)基因的代謝途徑，結(jié)果表明P53信號(hào)通路和DNA修復(fù)途徑在PRCC中上調(diào)。DNA損傷的修復(fù)在維持基因組完整性方面起著關(guān)鍵作用[25]。多種常規(guī)DNA修復(fù)途徑的多功能DNA修復(fù)中心經(jīng)常在癌癥中被改變[26]。有研究表明，DNA損傷修復(fù)途徑中不利等位基因數(shù)量的增加，會(huì)增加RCC風(fēng)險(xiǎn)[27]。不過也有證據(jù)表明，DNA修復(fù)基因多態(tài)性可能不會(huì)影響RCC的易感性，但可能會(huì)導(dǎo)致DNA修復(fù)能力的改變，從而影響腫瘤的進(jìn)展[28]。腫瘤抑制基因p53是人類癌癥中最常見的突變基因，在細(xì)胞凋亡、基因組穩(wěn)定性和抗血管生成中發(fā)揮作用，可以介導(dǎo)RCC細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[29]。研究表明，P53陽性表達(dá)與RCC病人預(yù)后不良和晚期臨床病理特征相關(guān)，這表明P53是一個(gè)潛在有效的治療靶點(diǎn)[30]。

綜上所述，利用生物信息學(xué)分析，我們共篩選了4 639個(gè)候選基因，其富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、代謝途徑、P53信號(hào)通路和DNA修復(fù)等途徑。這些發(fā)現(xiàn)可提高我們對(duì)PRCC病因和潛在分子事件的理解，這些候選基因和途徑有可能成為PRCC的治療靶點(diǎn)。

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（本文編輯 于國藝）