李萌　馬致潔　章從恩　章前　于衛(wèi)東　陳熹　趙奎君

摘要?目的：優(yōu)化構建抗抑郁研究的細胞實驗模型，探討西紅花對皮質(zhì)酮（CORT）誘導的PC12細胞損傷的保護作用及其相關機制。方法：觀察不同濃度（0、125、250、500、750、1 000 μmol/L）皮質(zhì)酮損傷PC12細胞24 h、36 h、48 h，CCK-8檢測細胞活力，優(yōu)化構建抑郁體外模型;不同濃度（2.5、5、10 μg/mL）西紅花預處理PC12細胞24 h，CCK-8檢測細胞活力，觀察西紅花對CORT（500 μmol/L）細胞損傷后的保護作用;檢測細胞培養(yǎng)上清中的LDH活性，判斷藥物對細胞膜的保護作用;使用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測藥物對CORT誘導的PC12細胞凋亡的保護作用;檢測細胞裂解液中Caspase-3活性，判斷藥物作用與Caspase蛋白通路相關性。結(jié)果：CORT（0～1 000 μmol/L）作用PC12細胞，細胞存活率隨藥物濃度的增加而逐漸降低，依劑量呈線性關系;當西紅花濃度>100 μg/mL時，對PC12細胞存活的影響出現(xiàn)統(tǒng)計學意義;西紅花預處理后，細胞存活率由模型組（53.31±4.18）%，上升為（57.46±2.76）%、（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%、（59.46±2.41）%、（58.64±3.74）%;西紅花預處理組LDH釋放量顯著低于模型組（P<0.05）;西紅花能夠明顯抑制CORT誘導的PC12細胞凋亡，西紅花可抑制Caspase-3的表達。結(jié)論：西紅花對CORT誘導的PC12細胞有一定保護作用。

關鍵詞?西紅花;皮質(zhì)酮;PC12細胞;誘導;細胞損傷;模型;抑郁

Protective Effects of the Crocus sativus L on CORT Induced PC12 Cell Injury

Li Meng1，Ma Zhijie1，Zhang Congen1，Zhang Qian2，Yu Weidong3，Chen Xi1，Zhao Kuijun1

（1 Department of Chinese Pharmacy，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China; 2 Beijing Keyuan Xinhai Pharmaceutical Business Co.，Ltd.，Beijing 100160，China; 3 Shanghai Traditional Chinese Medicine Co.，Ltd.，Shanghai 200002，China）

Abstract?Objective：To optimized the establishment of a model of depression in vitro，and to explore the protective effects of Crocus sativus L on PC12 cell injury induced by CORT and its related mechanisms.Methods：PC 12 cells were treated with CORT in different concentrations （0，125，250，500，750 and 1 000 μmol/mL） for 24，36 and 48 h to establish a depression model in vitro.PC12 cells were pretreated with Crocus sativus L at different concentrations （2.5，5 and 10 ug/mL） for 24 hours.Cell viability was measured by CCK-8，and the protective effects of Crocus sativus L on PC12 cell injury induced by CORT were determined.The levels of LDH activity in supernatant were detected to judge the protection effect of the drugs on PC12 cells.The protective effect on PC12 apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC/PI staining.Caspase-3 activity was detected in cell lysates and correlation between drug action and Caspase protein pathway was judged.Results：After CORT （0-1 000 μmol/L） treatment of PC12 cells for 24 h，the cell survival rates of each concentration were decreased with dose increasing in a dose-dependent manner.When the concentration of Crocus sativus Lextract was greater than 100 μg/mL，the effect on PC12 cells was statistically significant.After drug pretreatment，the PC12 cells survival rate was increased from model group （53.31±4.18）% to （57.46±2.76）%，（60.48±2.73）%，（61.99±3.05）%，（61.38±2.26）%，（59.46±2.41）% and （58.64±3.74）%，respectively.The release of LDH from Crocus sativus L pretreated group was significantly lower than that of model group （P<0.05）.Crocus sativus L can significantly inhibit CORT-induced apoptosis of PC12 cells.Crocus sativus Lcan inhibit the expression of Caspase-3.Conclusion：Crocus sativus L has the protective effects on PC12 cell injury induced by CORT.

Key Words?Crocus sativus L; Corticosterone （CORT）; PC12 cells; Induced; Cell injury; Model; Depression

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.009

抑郁癥，以持久而顯著的心境和情緒低落為主要臨床表現(xiàn)，是心境障礙的主要類型[1]。抑郁癥患者除情緒低落外，至少包含2種以上其他癥狀，包括失眠或嗜睡、易疲勞、飲食量改變以及出現(xiàn)自卑或絕望感等[2]。如不加以控制，會發(fā)展為更為嚴重的如雙向情感障礙等疾病，又因其不易被發(fā)現(xiàn)且病情綿長的特點導致抑郁癥的治療成為臨床的難點[3]。目前臨床治療抑郁癥的首選藥物為是五羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs），例如西酞普蘭、舍曲林和氟西汀等，但藥物的有效性不足六成，且起效時間平均需要6-8周[4]。與此同時，SSRIs的不良反應較多，例如患者骨折風險增加、出現(xiàn)靜坐不能和性功能障礙以及自殺傾向等較為嚴重的病癥[5]。因此有效且不良反應小的抗抑郁癥藥物的研發(fā)有著重要意義。

《本草綱目》中記載，西紅花（Crocus sativus L.）為鳶尾科番紅花屬植物的干燥柱頭，可“主心憂郁積，氣悶不散，活血，久服令人心喜”[6]。現(xiàn)代中醫(yī)在臨床使用中發(fā)現(xiàn)，西紅花可以治療和預防神經(jīng)退行性疾病等。因此西紅花治療異常心理狀態(tài)或行為的療效逐漸被人們關注[7]。目前，有部分實驗發(fā)現(xiàn)西紅花具有抗抑郁的藥效，但在細胞水平的研究成果較少。本研究使用皮質(zhì)酮（CORT）作用于低分化PC12細胞，建立抑郁癥體外模型。通過觀察西紅花對PC12細胞的保護作用，探討藥物的細胞保護和抗凋亡作用，為西紅花對抑郁癥的防治提供進一步的研究依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細胞?PC12細胞（購買自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所）用含10%的胎牛血清，1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，2～3 d傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.1.2?藥物?西紅花（上海藥材公司，批號：16120530）由首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定為鳶尾科番紅花屬西紅花Crocus sativus L.的干燥柱頭;皮質(zhì)酮（Corticosterone）（美國Sigma公司，批號：BCBP9232V）。

1.1.3?試劑與儀器

胎牛血清（美國HyClone公司，批號：1624110）;RPMI Medium 1640 basic（1×）培養(yǎng)基（美國gibco公司，批號：8118083）;青鏈霉素混合液（北京Solarbio科技有限公司，批號：68045655）;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（美國HyClone公司，批號：AD17628286）;0.25%胰蛋白酶溶液（美國gibco公司，批號：1928609）;CCK-8（日本Dojindo Lab公司，貨號53445）;二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司，批號：11381217）;乳酸脫氫酶試劑盒（LDH）（南京建成生物工程研究所，批號：446553）;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：748957）;Caspase-3活性檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：C1116）。

生物安全柜（美國Nuaire公司，型號：Labgard NV-425-400s）;CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司，型號：NV-5510E）;倒置生物顯微鏡（德國Leica公司，型號：Leica DMi1）;離心機（北京白洋離心機廠，型號：400C）;酶標儀（美國Molecular Device公司，型號：SpectraMax M3）;熒光顯微鏡（德國Leica公司，型號：DMI3000B）;細胞計數(shù)儀（美國Bio-rad公司，型號：TC20）;小型冷凍高速離心機離心機（德國Eppendorf公司，型號：5424R）;超純水機（美國Millipore公司，型號：Milli-Q）;電子天平（賽多利斯科學儀器公司，型號：BSA224S-CW）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ3200E）;-80 ℃醫(yī)用低溫冰箱[日本SANYO公司，型號：MDF-382E（N）];恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：DK-99-ll）。

1.2?方法

1.2.1?分組與藥物制備

1.2.1.1?CORT損傷模型構建分組?1）正常對照組（NC）：含1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做其他處理2）CORT模型組：100 μL含CORT濃度為：0、125、250、500、750、1 000 μmol/L的1%胎牛血清培養(yǎng)液，分別處理24、36、48 h。處理結(jié)束，檢測細胞存活率[8]。

1.2.1.2?西紅花毒性劑量篩選分組?1）正常對照組（NC）：含1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做其他處理2）西紅花組：西紅花儲備液用1%胎牛血清培養(yǎng)基配置不同濃度（此濃度為折算后的西紅花藥材濃度，簡稱西紅花濃度）：10、50、100、150、200 μg/mL，培養(yǎng)24 h，檢測細胞存活率。

1.2.1.3?西紅花給藥分組?1）正常對照組（NC）：含1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做其他處理2）CORT損傷模型組（M）：500 μmol/L CORT處理3）西紅花給藥組：含1%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋西紅花儲備液至不同濃度（1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL），均預給藥24 h，之后加入500 μmol/L CORT處理24 h，結(jié)束后檢測細胞存活率。根據(jù)實驗結(jié)果選擇低、中、高劑量組（簡寫為CL、CM、CH）。以下實驗均按該分組方式處理，收集細胞或培養(yǎng)上清進行后續(xù)實驗。

1.2.1.4?藥物制備?稱量34.6 mg CORT溶于1 mL DMSO溶液中，制成濃度為100 mmol/L的儲備液備用。稱量1 g西紅花藥材，粉碎后加入10 mL 75%乙醇超聲提取2 h，過濾，4 ℃放置一晚，濃縮后冷凍干燥，得提取物0.5 g，計算提取率約50%。西紅花提取物溶于水中，配置成2 mg/mL西紅花原藥材儲備液，4 ℃存儲備用。

1.2.2?檢測指標與方法

1.2.2.1?CCK-8細胞存活率檢測?取對數(shù)生長期PC12細胞以2×104個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，生長24 h，之后按照不同實驗分組進行處理，處理完成后，每孔加入10 μL的CCK-8，并設置空白對照，37 ℃孵育90 min后，在酶標儀450 nm波長下讀取吸光度。每組實驗設置6個復孔，每個實驗重復3次。按照公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組-空白對照組）/（對照組-空白對照組）×100%[9]。

1.2.2.2?細胞形態(tài)觀察?PC12細胞經(jīng)造模給藥處理后，于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學變化。

1.2.2.3?乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測?以5×105個/孔細胞向6孔細胞培養(yǎng)板接種PC12細胞，培養(yǎng)24 h后，按照1.2.1.3中試驗方法分組處理后，收集上清液，1 000 r/min離心5 min，進行乳酸脫氫酶測定，方法參照說明書。

1.2.2.4?Annexin V-FITC細胞凋亡檢測?以5×105個/孔細胞向6孔細胞培養(yǎng)板接種PC12細胞，培養(yǎng)24 h后，按照1.2.1.3中試驗方法分組處理后，進行Annexin V-FITC細胞凋亡檢測，方法參照試劑盒說明書，在熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。

LDH活性（U/L）=測定值-對照值標準值-空白值×標準品濃度×1 000

1.2.2.5?Caspase-3活性檢測?以5×105個/孔細胞向6孔細胞培養(yǎng)板接種PC12細胞，培養(yǎng)24 h后，按照1.2.1.3中試驗方法分組處理后，進行Caspase-3活性檢測，方法參照試劑盒說明書。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果

2.1?CORT損傷模型的選擇?采用CCK-8檢測細胞存活率，結(jié)果如圖1所示，不同濃度（0、125、250、500、750、1 000 μmol/L）CORT處理PC12細胞24 h后，細胞存活率分別是（100.00±1.37）%、（80.77±2.65）%、（76.94±1.60）%、（49.54±1.82）%、（36.71±2.14）%、（15.54±4.00）%，處理36 h后，細胞存活率分別是（100.00±1.76）%、（69.36±1.32）%、（55.92±1.25）%、（46.71±2.44）%、（14.84±0.94）%、（1.53±0.32）%處理48 h后細胞存活率分別是（100.00±7.73）%、（56.93±5.21）%、（56.15±6.11）%、（44.26±5.20）%、（18.24±2.05）%、（0.70±0.83）%，細胞存活率隨藥物濃度的增加而逐漸降低，依劑量呈線性關系。500 μmol/L CORT處理PC12細胞24 h后，細胞存活率下降到（49.54±1.82）%（P<0.01），引起約半數(shù)的PC12細胞死亡，根據(jù)實驗結(jié)果選擇濃度500 μmol/L處理24 h為本實驗的損傷模型。

2.2?西紅花毒性劑量?不同濃度西紅花處理細胞24 h后，CCK-8檢測細胞存活率為（100±6.18）%、（101.56±5.22）%、（96.37±4.58）%、（94.51±4.01）%、（94.05±2.96）%、（93.50±3.52）%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，當西紅花濃度大于100 μg/mL時，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖2），表明對細胞的存活有影響，因此選擇西紅花的濃度應小于100 μg/mL。

2.3?西紅花的細胞保護作用?不同濃度西紅花預處理細胞24 h后，加入500 μmol/L CORT作用24 h，細胞存活率由模型組（53.31±4.18）%，上升為（57.46±2.76）%、（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%、（59.46±2.41）%、（58.64±3.74）%。結(jié)果提示，西紅花對CORT引起的損傷具有保護作用，其中2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL時，細胞保護作用有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖3）。根據(jù)實驗結(jié)果，選用2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL作為西紅花處理的低（CL）、中（CM）、高（CH）劑量濃度，用于后續(xù)實驗分組[10]。

2.4?細胞形態(tài)學觀察?倒置顯微鏡下觀察PC12細胞，呈圓形、橢圓形或多角形，有的可見突觸，貼壁生長，折光性強。經(jīng)CORT處理后，細胞突觸收縮，細胞膜粗糙，折光性下降，貼壁狀態(tài)差甚至漂浮死亡。西紅花提取物處理組可見細胞損傷減弱，活細胞增多。見圖4。

2.5?LDH活性?LDH廣泛存在于細胞中，當細胞膜受損傷后，胞質(zhì)中的LDH釋放到培養(yǎng)基中，通過檢測細胞培養(yǎng)基中的LDH活性可以反映細胞的損傷程度[11]。本實驗正常組LDH活性為（245.39±22.35）U/L，模型組為（439.30±32.03）U/L，CL組為（421.63±20.41）U/L，CM組為（394.67±8.96）U/L，CH組為（348.95±28.57）U/L。測定結(jié)果顯示，CORT損傷組與對照組比，LDH活性顯著升高（**P<0.01）;藥物保護組與模型組比顯著降低（△P<0.05）。見圖5。

2.6?Annexin V-FITC細胞凋亡檢測?通過Annexin V-FITC/PI雙染色法，使用熒光顯微鏡對凋亡細胞進行形態(tài)學觀察，結(jié)果如圖6所示。圖中綠色熒光為Annexin V-FITC染色陽性細胞，紅色熒光為PI染色陽性細胞。僅被綠色熒光染色的為凋亡細胞，被綠色和紅色熒光雙染的是壞死細胞，未被熒光染色的為正常細胞。NC組Annexin V-FITC熒光強度非常弱，表明PC12細胞處于正常狀態(tài);模型組熒光強度明高于NC組，表明CORT誘導的PC12細胞發(fā)生明顯的細胞凋亡以及細胞死亡。CL、CM以及CH組熒光強度逐漸降低，細胞凋亡及壞死細胞的數(shù)量明顯下降，表明西紅花能夠較為有效的抑制CORT誘導的PC12細胞凋亡。

2.7?Caspase-3活性檢測?Caspase是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族，Caspase-3是其中一個關鍵酶，其介導的蛋白剪切是細胞凋亡分子機制的重要組成部分。通過檢測細胞裂解液中的Caspase-3活性可以反映細胞凋亡程度。本實驗結(jié)果正常組Caspase-3活性為（7.05±0.12）μmol/L，模型組為（15.48±0.48）μmol/L，CL組為（10.86±0.79）μmol/L，CM組為（8.90±0.15）μmol/L，CH組為（7.62±0.83）μmol/L。測定結(jié)果顯示，CORT損傷組與對照組比，Caspase-3活性顯著升高（**P<0.01）;藥物保護組與模型組比顯著降低（△P<0.05），結(jié)果見圖7。

3?討論

西紅花的主要成分為西紅花苷-I、藏花醛和山柰酚等[12]。研究表明，其具有抗氧化活性和神經(jīng)保護作用[13]。并且有Meta分析得出結(jié)論，補充服用西紅花可以改善輕度至中度抑郁癥患者的臨床癥狀[14]。但其起效的生物過程和細胞體外抑郁模型的保護作用及機制尚不明確。因此，在本研究中，我們使用CORT誘導PC12細胞損傷，構建抑郁癥體外模型，通過檢測細胞存活率、LDH釋放率、Annexin V-FITC/PI雙染色法和Caspase-3活性，探討西紅花對CORT致PC12細胞損傷的保護作用。

PC12細胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞，具有類似于神經(jīng)細胞的一般特征[15]。由于PC12細胞具有易獲取、可傳代、增殖迅速等優(yōu)點，使其在抑郁癥研究中應用廣泛[16]。CORT是一種糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids，GC），是HPA軸（Hypothalamic-pituitary-gonadal，HPA）的終末產(chǎn)物，CORT濃度增加可導致神經(jīng)細胞損傷，產(chǎn)生抑郁樣行為[17]。因此高濃度CORT誘導PC12細胞損傷模型廣泛應用于抑郁的體外實驗中。本實驗觀察到，CORT對PC12細胞有明顯的損傷作用，呈劑量依賴性。500 μmol/L CORT損傷24 h，細胞存活率下降到（49.54±1.82）%，且穩(wěn)定可重復，因此選用此濃度作為該實驗損傷模型。2.5 μg/mL、5 μg/mL和10 μg/mL西紅花預處理細胞，造模后檢測細胞存活率，分別為（60.48±2.73）%、（61.99±3.05）%、（61.38±2.26）%，差異有統(tǒng)計學意義，因此選為藥物保護的模型濃度。

本研究探討了西紅花對CORT誘導的PC12細胞損傷的保護作用，結(jié)果表明，西紅花可提高損傷后細胞的存活率，減少細胞膜損傷的LDH釋放量，且能夠明顯減少PC12細胞凋亡及死亡數(shù)量。通過倒置顯微鏡和Annexin V-FITC/PI雙染色法于熒光顯微鏡下觀察，CORT造模后，PC12細胞出現(xiàn)突觸收縮、折光性差、細胞膜粗糙等損傷及凋亡典型特征，加入西紅花處理后，其上述特征及凋亡熒光明顯減少。說明了西紅花對PC12細胞的凋亡具有一定的改善作用。Caspase-3是凋亡領域研究的熱點，它是凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的最終通路，活化的Caspase-3切割下游相應的胞質(zhì)胞核底物導致細胞凋亡從而發(fā)揮促凋亡作用。當受到外界刺激時，體內(nèi)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間協(xié)同作用，共同決定細胞是否進入凋亡程序。在本實驗中，與對照組比較，模型組細胞凋亡蛋白Caspase-3活性明顯升高，西紅花進行干預后，Caspase-3蛋白的表達明顯減少，這些說明了CORT誘導的PC12細胞的凋亡可能與Caspase-3依賴的凋亡通路有關，西紅花可抑制該凋亡蛋白的表達。綜上表明西紅花能夠有效的保護CORT誘導的PC12細胞的損傷。但西紅花抗抑郁的物質(zhì)基礎和更為確切的分子機制及信號通路并還尚未明確，其具體機制尚需進一步探究。

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