孫婷 張菁 劉云 姜建國 蔣凝

中圖分類號 R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0469-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.08

摘 要 目的：建立同時測定尼爾雌醇片和己烯雌酚片中主藥含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為 Waters Symmetry C18，流動相為0.02 mol/L乙酸銨水溶液-乙腈（40 ∶ 60，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：尼爾雌醇、己烯雌酚檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為0.01～0.5 mg/mL（ r均為 0.999 9）；定量限分別為187、192 ng/mL，檢測限分別為56、58 ng/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于1%（n=6）；加樣回收率分別為99.13%～100.80%（RSD=0.52%，n=9）、99.20%～100.90%（RSD=0.58%，n=9）。結(jié)論：該方法靈敏度高、重復(fù)性好，可用于同時測定雌激素類藥物尼爾雌醇片中尼爾雌醇和己烯雌酚片中己烯雌酚的含量。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；雌激素類藥物；尼爾雌醇；己烯雌酚；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of main drug contents in Nilestriol tablet and Diethylstilbestrol tablet. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Waters Symmetry C18 column with mobile phase consisted of 0.02 mol/L ammonium acetate water solution-acetonitrile （40 ∶ 60，V/V） at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of nilestriol and diethylstilbestrol were 0.01-0.5 mg/mL （r=0.999 9）； the limits of quantitation were 187 and 192 ng/mL， and the limits of detection were 56 and 58 ng/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 1% （n=6）. The recoveries of them were 99.13%-100.80%（RSD=0.52%，n=9） and 99.20%-100.90%（RSD=0.58%， n=9）. CONCLUSIONS： The method is more sensitive and reproducible， and suitable for simultaneous determination of nilestriol content in estrogenic hormone drug Nilestriol tablets and diethylstilbestrol content in Diethylstilbestrol tablets.

KEYWORDS HPLC； Estrogenic drugs； Nilestriol； Diethylstilbestrol； Content determination

尼爾雌醇（Nilethylenol）又名戊炔雌三醇，化學(xué)名為3-（環(huán)戊氧基）-19-去甲基-17α-孕甾-1，3，5（10）-三烯-20-炔-16α，17-二醇，屬于雌三醇衍生物；己烯雌酚（Diethylstilbestrol）又名丙酸己烯雌酚，化學(xué)名為（E）-4，4′-（1，2-二乙基-1，2-亞乙烯基）雙苯酚，是人工合成的非甾體雌激素類藥物；兩者均為雌激素類處方藥，臨床均用于雌激素缺乏引起的絕經(jīng)期或更年期綜合征，其主要不良反應(yīng)均為突破性出血、子宮出血等。因此，有必要嚴(yán)格、有效、精準(zhǔn)地控制尼爾雌醇片和己烯雌酚片的質(zhì)量。雖然尼爾雌醇片和己烯雌酚片的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均已收載于2015年版《中國藥典》（二部）[1]，尼爾雌醇片采用紫外-可見分光光度法測定含量，己烯雌酚片采用高效液相色譜法（HPLC）測定含量，且與2005年版《中國藥典》（二部）完全相同[2]，但其標(biāo)準(zhǔn)項目的設(shè)置及檢測方法等多方面仍有待提高。為此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-12]，建立了采用HPLC法同時測定雌激素類藥物尼爾雌醇片中尼爾雌醇和己烯雌酚片中己烯雌酚的含量，旨在為該類藥物的質(zhì)量控制及同類藥物的一測多評提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695型HPLC儀，包括2489紫外檢測器、e2695四元梯度輸液泵、Waters色譜工作站（美國Waters公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettle-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

尼爾雌醇對照品（批號：100239-200702，純度：99.4%；使用前需80 ℃減壓干燥2 h）、己烯雌酚對照品（批號：100033-200607，純度：99.9%；使用前不需要干燥處理）均由中國食品藥品檢定研究院提供；尼爾雌醇片（批號：170103、170104、170105，規(guī)格：1 mg/片）、己烯雌酚片（批號：170201、170202、170203，規(guī)格：1 mg/片）均由A公司提供；乙腈為色譜純（Fisher，美國Scientific 公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L乙酸銨水溶液-乙腈（40 ∶ 60，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取尼爾雌醇對照品、己烯雌酚對照品各100 mg，分別置于10 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度均為10 mg/mL的尼爾雌醇對照品貯備液和己烯雌酚對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液各1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得尼爾雌醇對照品溶液和己烯雌酚對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取尼爾雌醇片20片，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉（約相當(dāng)于尼爾雌醇10 mg）適量，置于10 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為尼爾雌醇供試品貯備液；精密量取上述尼爾雌醇供試品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得尼爾雌醇供試品溶液。另取己烯雌酚片20片，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉（約相當(dāng)于己烯雌酚10 mg）適量，置于10 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為己烯雌酚供試品貯備液；精密量取上述己烯雌酚供試品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得己烯雌酚供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方工藝分別制備缺尼爾雌醇和己烯雌酚的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法分別制備陰性樣品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取尼爾雌醇對照品、己烯雌酚對照品5 mg，分別置于10 mL量瓶中，加30%過氧化氫溶液5 mL，于70 ℃加熱10 min，分別制得尼爾雌醇系統(tǒng)適用性溶液和己烯雌酚系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密量取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液、系統(tǒng)適用性溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，尼爾雌醇峰保留時間約為15 min，與各雜質(zhì)峰的分離度均大于2.0，理論板數(shù)不低于3 000；己烯雌酚峰保留時間約為5 min，與雜質(zhì)峰的分離度均大于2.0，理論板數(shù)不低于3 000。尼爾雌醇峰和己烯雌酚峰與溶劑及其他雜質(zhì)峰分離良好，陰性樣品對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項下尼爾雌醇對照品貯備液、己烯雌酚對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置于100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得尼爾雌醇、己烯雌酚回歸方程分別為y=9.591 7×108x+2.482 2×106（r=0.999 9）、y=3.120 4×109x+7.689 7×106（r=0.999 9）。結(jié)果表明，尼爾雌醇、己烯雌酚檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為0.01～0.5 mg/mL。

2.5 定量限與檢測限考察

分別取“2.2.1”項下尼爾雌醇對照品溶液、己烯雌酚對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1計算定量限、檢測限。結(jié)果，尼爾雌醇、己烯雌酚的定量限分別為187、192 ng/mL，檢測限分別為56、58 ng/mL。

2.6 精密度試驗

分別取“2.2.1”項下尼爾雌醇對照品溶液、己烯雌酚對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，尼爾雌醇、己烯雌酚峰面積的RSD分別為0.19%、0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下尼爾雌醇供試品溶液（批號：170103）、己烯雌酚供試品溶液（批號：170201）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，尼爾雌醇、己烯雌酚峰面積的RSD分別為0.53%、0.59%（n=7），表明尼爾雌醇供試品溶液、己烯雌酚供試品溶液于室溫下放置12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取尼爾雌醇片（批號：170103）、己烯雌酚片（批號：170201）適量，各6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算待測成分含量。結(jié)果，尼爾雌醇、己烯雌酚的平均含量分別為98.66%、98.57%，RSD分別為0.17%、0.11%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的尼爾雌醇片（批號：170103）、己烯雌酚片（批號：170201）100 mg，各9份，分別置于10 mL量瓶中，各加一定量的尼爾雌醇對照品溶液、己烯雌酚對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算含量和加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.10 樣品含量測定

取6批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

雌激素類藥物是以18個碳原子雌烴為基本結(jié)構(gòu)的類固醇激素[13]，分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。目前常用的測定雌激素類藥物含量的方法有紫外-可見光光度法、薄層色譜法、氣相色譜法、HPLC法、放射免疫分析法及酶聯(lián)免疫吸附法等[13]。隨著分析技術(shù)的提高和分析儀器的發(fā)展，HPLC法被廣泛使用。該方法不僅具有樣品用量少、靈敏度高、快速等優(yōu)點，還具有分離效能好等特點，因此可用于雌激素類藥物含量的測定[13]。

筆者前期采用了2015年版《中國藥典》（二部）[1]的方法測定了尼爾雌醇片中尼爾雌醇和己烯雌酚片中己烯雌酚的含量；與HPLC法比較后發(fā)現(xiàn)，HPLC法的測定結(jié)果比紫外-可見分光光度法略低1%，提示紫外-可見分光光度法易受輔料及雜質(zhì)干擾，造成檢測結(jié)果不夠準(zhǔn)確，而HPLC法能夠滿足檢驗需求，靈敏度高、準(zhǔn)確度好。

綜上所述，本研究所建方法靈敏度高、重復(fù)性好，可用于同時測定雌激素類藥物尼爾雌醇片中尼爾雌醇和己烯雌酚片中己烯雌酚的含量，該方法能夠提高檢驗效率、節(jié)約資源，又能夠為同類藥物一測多評提供有效的技術(shù)支持。

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（收稿日期：2018-04-13 修回日期：2018-12-03）

（編輯：陳 宏）