黃野螟中性肽鏈內(nèi)切酶基因表達的時空動態(tài)

呂子豪 王春燕 林同

摘要：從黃野螟（Heortia vitessoides Moore）轉(zhuǎn)錄組文庫中成功篩選到具有完整ORF框的黃野螟中性肽鏈內(nèi)切酶基因（ NEP）序列，命名為HvNEP（登錄號：MH298329）。該序列ORF框長2 310 bp，共編碼769個氨基酸。同源比對分析結(jié)果表明，HvNEP蛋白氨基酸序列與棉鈴蟲（Helicoverpa armigera Hubner） NEP蛋白氨基酸序列的同源性最高，達79%。RT-qPCR結(jié)果顯示，HvNEP在黃野螟成蟲中表達量最高，為卵（對照）的113. 77倍。HvNEP在黃野螟不同組織間存在表達差異，幼蟲階段在頭部表達量最高，為體壁（對照）的5.28倍。成蟲階段，HvNEP在翅中表達量最高，為腹（對照）的11.06倍，在足中最低（0.11倍）。分析黃野螟NEP時空表達動態(tài)發(fā)現(xiàn)，HvNEP可能與昆蟲行為的調(diào)控及神經(jīng)系統(tǒng)的完善有關(guān)。在60 ng/μl和120 ng/μl的20-羥基蛻皮激素（20E）脅迫下，HvNEP表達量均高于對照，表明HvNEP作為蛻皮激素的次級應(yīng)答基因，其表達受20-羥基蛻皮激素調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞：黃野螟;中性肽鏈內(nèi)切酶;蛻皮激素

中圖分類號： S435.79

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0573-08

黃野螟（Heortia vitessoides）屬鱗翅目（Lepi-doptera）草螟科（Crambidae）齒螟亞科（Odonti-inae），是植物土沉香（Aquilaria sinensis）的重要食葉害蟲[1-2]。該蟲在中國南部分布廣泛，主要活動范圍在廣東省、廣西省、海南省、云南省、福建省以及中國臺灣和香港等地[1]。其幼蟲生長發(fā)育迅速，在爆發(fā)時期，蟲口密度大，食量大，短時間內(nèi)便可吃光被害樹葉片，嚴(yán)重影響土沉香的產(chǎn)量和結(jié)香質(zhì)量[3]。近年來，隨著廣東和海南等地大規(guī)模種植土沉香，黃野螟蟲害問題愈發(fā)嚴(yán)重。

蛋白酶在多種生理系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，其中M13家族的中性肽鏈內(nèi)切酶（NEP）參與神經(jīng)肽和肽激素的加工，主要由膜結(jié)合鋅蛋白酶組成[4]。NEP屬于M13鋅金屬蛋白酶家族，是一種Ⅱ型整合細胞膜糖蛋白[5]，存在于多種細胞膜上。1974年，Ma等首次在兔腎小管的刷狀緣發(fā)現(xiàn)NEP[6]。2001年，Zhao等在一種無脊椎動物家蠶（Bombyx mori）中克隆出中性肽鏈內(nèi)切酶24.11 -like基因，并將其命名為bmNEP-l[7]。隨后Butler研究發(fā)現(xiàn)，NEP在果蠅胸側(cè)板、背側(cè)和腹側(cè)鉸鏈中均有表達[8]。NEP與昆蟲頭部和足部的再生有關(guān)[9]。

M13金屬蛋白酶參與調(diào)控哺乳動物的疾病，例如阿爾茨海默病[10-11]、炎癥[12]、癌癥[13]等，亦會影響生殖健康與繁殖[4，14-15]。然而，關(guān)于它們在昆蟲中的生理作用研究較少。僅有的研究結(jié)果表明，NEP作為20-羥基蛻皮激素（20 -hydroxyecdysone，20E）次級應(yīng)答基因，可能參與昆蟲變態(tài)發(fā)育[9]和翅原基的形成[7，16]。研究NEP不僅對明確昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義，而且對經(jīng)濟昆蟲的利用、農(nóng)林害蟲的控制和昆蟲生長調(diào)節(jié)劑與生物害蟲農(nóng)藥的開發(fā)具有重要指導(dǎo)價值。因此，本研究從黃野螟轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選NEP基因，并對其進行生物信息學(xué)及時空表達分析，旨在為黃野螟NEP基因及其編碼的蛋白質(zhì)研究提供分子生物學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃野螟幼蟲采自廣州天鹿湖森林公園，1-5齡幼蟲在培養(yǎng)箱中用土沉香葉片飼養(yǎng)，老熟幼蟲移至鋪有沙土的塑料養(yǎng)蟲盒中，待其化蛹羽化。飼養(yǎng)溫度為26℃，相對濕度為70% - 75%，光照周期為光/暗= 14 h/10 h。

總RNA提取試劑盒（E.Z.N.ATM Total RNAKitⅡ），購自O(shè)MEGA公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Pri-meScript RT reagent Kit With gDNA Eraser）及實時熒光定量試劑盒（ TB Green premix Ex TaqTM），均購自TaKaRa公司。20E試劑購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理選取40頭健康的4齡幼蟲，經(jīng)無菌水清洗后，在臘盤上解剖，獲得幼蟲的頭、體壁、脂肪體、中腸、馬氏管等樣品，立即置于無菌去酶的EP管中，經(jīng)液氮速凍后，存放在-80 ℃冰箱中備用。選取30頭健康的1日齡成蟲在臘盤上解剖，獲取成蟲的觸角、足、頭、胸、腹、翅等組織樣品，立即置于無菌去酶的凍存管中，經(jīng)液氮速凍后，存放于-80℃冰箱中備用。用二甲基亞砜（ DMSO）將20-羥基蛻皮激素（20E）稀釋至10 mg/ml，存放于-20 ℃冰箱備用。用lxPBS將20E稀釋至60 ng/μl和120 ng/μ 2個質(zhì)量濃度，并分別從蟲體腹部側(cè)面注射。注射前用75%酒精擦拭蟲體，每頭注射lμl，對照注射等量稀釋的DMSO。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 按照E.Z.N.A Total RNA KitⅡ提取試劑盒說明書提取各樣品總RNA。檢測合格后，置于-80 μ冰箱中保存?zhèn)溆?。按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA E—raser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行第一鏈cDNA合成，合成后稀釋20倍，作為實時熒光定量PCR（ RT-qPCR）反應(yīng)的模板，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計及基因的表達以4齡幼蟲cDNA為模版，通過普通PCR擴增目的基因及內(nèi)參基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，條帶大小符合預(yù)期且無雜帶，并測序確認。RT-qPCR的熔解曲線只有1個信號峰，說明引物特異性高，結(jié)果可靠。用實時熒光定量PCR反應(yīng)（RT-qPCR）檢測基因的表達量，所用引物為：5’-GCTGATGGAGTCCGTGCT-GAAC-3’ 和5'-CGAGTAGAAGGCGTTGACGATGG-3'，內(nèi)參基因為盧-actin，陰性對照為無菌超純水。反應(yīng)體系為：cDNA模板20.0μl，TB Green Premix ExTaq 10.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，ddH20 7.2μl。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min; 95℃解鏈10 s，60℃延伸20 s，共進行40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，使用LightCy-cle480熒光定量PCR儀自帶的分析軟件，選擇相對定量分析模式并導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，使用2-△△Ct相對定量法計算NEP的相對表達量，2-△△Ct即為目的基因的相對表達倍數(shù)。采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析與鄧肯氏多重比較分析，采用GraphPadPrism 5繪圖。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 在NCBI網(wǎng)站（http：//blast。st-va. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）進行基因序列同源比對，用P rotP aram軟件分析理化性質(zhì)，用Signal P 4.1（http： //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP -4.11）進行信號肽預(yù)測，用NetNGlye軟件分析Ⅳ一糖基化修飾（ http：//www. cbs.dtu），用NetPhos3.1（ http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/）預(yù)鋇 iJ磷酸化修飾位點，用TMpred軟件（https：//embnet.vital-it. ch/cgi-bin/）進行跨膜區(qū)分析，用PSORT軟件（ https：//psort. hgc.j p/cgi-bin/runpsort. pl）進行亞細胞定位，用NPS在線工具（https：//npsa-prabi.ibcp. fr/cgi-bin/secpred—gor4.pl）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL在線工具（https：//www.swissmodel. expasy. org/interactive/yrSsgx/models/）進行蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)建模，用ClustalX軟件和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（NJ法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃野螟中性肽鏈內(nèi)切酶基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

從黃野螟cDNA文庫中篩選出具有完整ORF框的中性肽鏈內(nèi)切酶基因，將其命名為HvNEP（登錄號：MH298329），序列包含2 310 bp長的ORF框，編碼769個氨基酸（圖1）。使用ProtParam軟件分析HvNEP的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)的分子量為86 909.14，等電點為6.76，脂肪系數(shù)為80.59，不穩(wěn)定指數(shù)為38. 49。總平均疏水性計算結(jié)果為-0.335，推測其為親水性蛋白質(zhì)。NetPhos3.1軟件分析結(jié)果顯示HvNEP含有9個酪氨酸磷酸化位點，23個蘇氨酸磷酸化位點和42個絲氨酸磷酸化位點（得分>0.5）。NetNGlye軟件分析結(jié)果顯示HvNEP有6個糖基化位點。SignalP在線工具預(yù)測結(jié)果顯示，HvNEP無信號肽，推測其為非分泌蛋白質(zhì)。非分泌蛋白質(zhì)不存在N-糖基化位點，所以我們推測6個預(yù)測的糖基化位點只是潛在的位點。TMpred軟件分析結(jié)果表明，HvNEP為跨膜蛋白質(zhì)，具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中得分大于2 000的2個重要跨膜區(qū)域中，一個是從內(nèi)向外的，位于37至56位氨基酸，另一個從外向內(nèi)的重要跨膜區(qū)域位于32至56位氨基酸。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，HvNEP位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性最大（為30.4%），其次是位于線粒體（有26.1%的可能性），位于高爾基體和細胞質(zhì)的可能性則較低（均為17.4%），位于細胞核的可能性最低（4.3%）。

使用Sopma軟件進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示構(gòu)成HvNEP蛋白的主要元件為α螺旋和無規(guī)則卷曲，分別占50.20%和37.71%。此外，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角，則各占8.58%與3.51%。使用SWISS-MODEL軟件進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果顯示HvNEP基因編碼的蛋白質(zhì)主要由α螺旋與無規(guī)則卷曲組成（圖2），預(yù)測結(jié)果與Sopma軟件預(yù)測的一致。Conserved Domains軟件分析結(jié)果顯示，HvNEP屬于鋅谷氨酸蛋白超基因家族中的M13家族，包含鋅結(jié)合基序HEITH和2個重要催化基序VNAFY和GENIAD[1]（圖1）。

2.2 HvNEP序列的同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過Blast與MEGA5.0軟件進行同源性比對，結(jié)果顯示HvNEP序列與棉鈴蟲NEP的同源性最高（79%），與煙粉虱（Bemisia Tabaci）的同源性最低（67%）（圖3）。為研究HvNEP與其他物種昆蟲間的親緣關(guān)系，基于其與鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目等4個目中10種昆蟲的NEP蛋白氨基酸序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，黃野螟與煙粉虱同源性最低，與棉鈴蟲處于同一分支（圖4）。

2.3 HvNEP基因在黃野螟不同蟲態(tài)和不同組織中的表達

由圖5可知，HvNEP在黃野螟各蟲態(tài)中均有表達，且各蟲態(tài)間差異顯著。在成蟲中表達量達到峰值，為卵的113.77倍;在3齡和4齡幼蟲時表達量最低，僅為卵的1.31倍和0.60倍。由圖6可知，HvNEP在黃野螟幼蟲各組織中均有表達，在體壁中表達量最低。在頭部表達量最高，為體壁的5.28倍;其次是馬氏管中，表達量為體壁的2.89倍。成蟲時，HvNEP在翅中表達量最高，為腹的11.06倍，其次是觸角與頭，表達量分別為腹的3.75倍與2.08倍（圖7）。為研究蛻皮激素對HvNEP表達量的影響，以等量稀釋的DMSO為對照，探討不同時間不同20E質(zhì)量濃度梯度下HvNEP的表達量差異（圖8）。在20E注射質(zhì)量濃度為60 ng/μI時，HvNEP的表達量隨時間增加而升高，但在24 h時黃野螟HvNEP基因的表達變化不明顯，在48 h和72h時HvNEP基因的表達量顯著提高;在注射質(zhì)量濃度為120 ng/μl時，HvNEP的表達量隨時間的增加先升高后降低，在48 h時表達量達到峰值，為對照的74.03倍。說明HvNEP基因的表達水平受蛻皮激素調(diào)控，且在注射質(zhì)量濃度為120 ng/μl后48 h，蛻皮激素對其表達量的影響最顯著。

3 討論

Neprilysin（ M13）家族蛋白高度保守部分為HEITH鋅結(jié)合基序和2個重要的催化基序VNAFY和GENIAD[17]。VNAFY基序存在于各種昆蟲的M13肽酶中，影響底物對P1和P1’位置間肽鍵的取向[18-19]，其結(jié)構(gòu)的變化可能會對酶性質(zhì)產(chǎn)生連鎖效應(yīng)[17];GENIAD已被證明是影響內(nèi)肽酶活性的關(guān)鍵。此基序若發(fā)生顯著變異，很可能導(dǎo)致酶活性喪失[20]。

在昆蟲生長過程中，NEP基因參與昆蟲的變態(tài)[9]。RT-qPCR結(jié)果表明，HvNEP在黃野螟各發(fā)育階段均有表達，在1齡和2齡幼蟲期表達量較高，分別為卵的6.44倍和5.97倍。有研究結(jié)果表明，過表達Neprilysin2基因會導(dǎo)致果蠅表現(xiàn)出新的行為表型（異常攀爬行為），說明果蠅運動的改變可能是神經(jīng)肽信號遭到干擾所致[21]。同屬中性肽鏈內(nèi)切酶（M13）家族的HvNEP可能也與神經(jīng)肽信號有關(guān)，并在黃野螟1齡和2齡幼蟲期發(fā)揮重要作用。HvNEP在成蟲期的表達量極為突出，為卵的113.77倍。我們推測，黃野螟羽化后存活時間較短，因此其成蟲神經(jīng)系統(tǒng)需要迅速發(fā)育，神經(jīng)肽和肽激素的合成變得旺盛，為生殖行為做好準(zhǔn)備，與之相關(guān)的HvNEP基因在此階段應(yīng)有極高的表達量。

大多無脊椎動物存在類NEP活性物質(zhì)[22]。RT-qPCR結(jié)果表明，HvNEP基因在黃野螟幼蟲各組織中均有表達，在頭部的表達量最高，為體壁的5.28倍。腦是昆蟲的神經(jīng)中樞，調(diào)控昆蟲行為和生理活動[23]。推測HvNEP參與調(diào)控黃野螟幼蟲腦神經(jīng)發(fā)育與神經(jīng)肽酶水平[24-25]。昆蟲馬氏管不僅有助于昆蟲排泄代謝廢物和調(diào)節(jié)水鹽平衡[26]，還具有免疫調(diào)控功能[27]，神經(jīng)肽在昆蟲免疫過程中起一定作用[28]。本研究結(jié)果顯示HvNEP在馬氏管中表達量較高，推測其與馬氏管行使免疫功能有關(guān)。

分析成蟲組織熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HvNEP在成蟲觸角和頭均有較高表達，分別為腹的3.75和2.08倍。蛾類昆蟲嗅覺中樞發(fā)達，觸角內(nèi)含豐富的神經(jīng)纖維球[29]，HvNEP可能參與成蟲嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)的完善。HvNEP在成蟲翅中表達量最高，為腹的11.06倍。有研究結(jié)果表明，在蛻皮激素誘導(dǎo)下，翅原基中會形成類NEP活性物質(zhì)[16]。翅是昆蟲的飛行器官，而神經(jīng)肽信號系統(tǒng)調(diào)控昆蟲的行為[28]，NEP參與神經(jīng)肽的加工[4]，推測HvNEP在翅中的高表達與昆蟲行為有密切關(guān)系。

蛻皮激素在動植物體中普遍存在，能夠誘導(dǎo)昆蟲組織細胞程序化死亡[30]，20E是其在昆蟲體內(nèi)的活性形式。當(dāng)昆蟲體內(nèi)保幼激素滴度較高時，20E引起昆蟲脫皮，當(dāng)保幼激素滴度較低時，20E誘導(dǎo)昆蟲進入下一齡期或發(fā)生變態(tài)[31]。本研究對黃野螟進行了外源20E脅迫，在注射20E后24 h，黃野螟HvNEP的表達水平上升，且注射質(zhì)量濃度越高影響越明顯。當(dāng)注射質(zhì)量濃度為60 ng/μl時，HvNEP的表達量隨時間增加而上升;當(dāng)注射質(zhì)量濃度為120ng/μl時，HvNEP的表達量隨時間增加先上升后降低。此結(jié)果說明，HvNEP作為蛻皮激素的次級應(yīng)答基因，其表達受20E調(diào)節(jié)。另外，注射不同質(zhì)量濃度的蛻皮激素對HvNEP基因表達量的影響不同，在注射后72 h，120 ng/μl的外源20E對HvNEP表達的誘導(dǎo)效果不如60 ng/μl，推測較高質(zhì)量濃度的20E脅迫會激發(fā)蟲體內(nèi)的負反饋調(diào)節(jié)機制。

本研究結(jié)果為探究昆蟲中性肽鏈內(nèi)切酶基因提供了分子依據(jù)。NEP是昆蟲生長發(fā)育中不可或缺的一員，具有成為害蟲控制劑靶標(biāo)的潛力。后期我們將基于本研究成果，運用基因編輯和RNA干擾技術(shù)，更深入地研究HvNEP的功能。

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