潘寶貴 錢恒彥 戈偉 劉金兵 郭廣君 刁衛(wèi)平 王述彬

摘要：辣椒原產(chǎn)中南美洲熱帶地區(qū)，為喜溫性蔬菜作物。冷害是辣椒生產(chǎn)中的主要逆境因子，嚴重影響辣椒的生長發(fā)育。遭受冷害脅迫時，包括辣椒在內(nèi)的眾多植物通過多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)耐冷相關(guān)基因的表達，提高植物的耐冷性。本文從冷信號感知、冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、耐冷基因表達等方面，綜述了辣椒應(yīng)答冷信號的研究進展，從而為辣椒耐冷分子機制研究提供參考。

關(guān)鍵詞：辣椒;冷害;信號轉(zhuǎn)導(dǎo);轉(zhuǎn)錄因子;耐冷基因

中圖分類號：S641.3

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（2019）03 -0743 -06

辣椒（Capsicum spp.）原產(chǎn)中南美洲熱帶地區(qū)，屬于喜溫性蔬菜作物，冷害脅迫對辣椒生長發(fā)育會造成不利的影響。低于15℃低溫條件下，辣椒種子萌發(fā)時間延長，發(fā)芽率下降，幼苗葉片萎蔫，株高、莖粗、葉長、葉寬等生長指標逐漸減小，花器發(fā)育不良，產(chǎn)量下降，直至植株倒伏、死亡[1-5]。中國辣椒種植面積1.5x10～ 2.Ox10 hm，主要分布于北方保護地種植區(qū)、北方露地種植區(qū)、南菜北運基地、高山種植區(qū)、夏菜基地和華中露地種植區(qū)等6個區(qū)域[6-7]。近年來，冬春季氣候變化異常，雨雪、倒春寒頻發(fā)等冷害天氣嚴重影響了辣椒生產(chǎn)的效益。選用耐冷品種是緩減冷害的經(jīng)濟有效措施。辣椒育種研究者常將耐冷育種作為抗逆育種的主攻目標，已經(jīng)選育出一批耐低溫辣椒品種，例如蘇椒1614適合長江流域冬春季保護地栽培，勝寒740適合北方保護地早春茬種植[8]，中椒106號適合高山種植區(qū)栽培[6]。

對冷信號感知、冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、下游基因表達等的研究結(jié)果表明，植物通過復(fù)雜的冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提高耐冷性。其中研究得較為清晰的為ICE-CBF-COR途徑：植物通過細胞膜感知低溫信號，細胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生改變，bHLH型轉(zhuǎn)錄因子ICEI（ Inducer of CBFExpression l）激活，通過順式作用元件調(diào)控CBF（C—repeat binding factor）表達，與冷調(diào)節(jié)（Cold-regulated，COR）基因啟動子CRT/DRE元件特異結(jié)合，啟動COR基因的表達，植物的耐冷性提高[9-12]。在辣椒耐冷機制研究方面，鈣離子（Ca2+）、脫落酸（ ABA）、活性氧清除物質(zhì)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等在辣椒冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用越來越明晰，特別是2014年辣椒全基因組數(shù)據(jù)的公布，辣椒耐冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CBF、WRKY、NAC、MYB及冷響應(yīng)基因的分子機制研究受到普遍關(guān)注。本文據(jù)此綜述辣椒冷信號感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、冷調(diào)節(jié)基因等方面的研究進展，為辣椒耐冷分子機制研究及耐冷新種質(zhì)創(chuàng)制提供參考。

1 辣椒對冷信號的感知

1.1 通過Ca2+感知冷信號

植物通過多個溫度感受器感知溫度信號，盡管相關(guān)分子機制尚不明確，但Ca2+在維持細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，延緩膜損傷中起重要作用13]。最新研究結(jié)果表明，植物可能通過跨膜結(jié)構(gòu)蛋白COLDI（ chilling-tol-erance divergence l）感知冷信號。水稻質(zhì)膜上跨膜結(jié)構(gòu)蛋白COLDI，通過三亞基G蛋白來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)第二信使Ca2+濃度的變化[14]，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白（ CaM），形成鈣信號（Ca2+/CaM）系統(tǒng)，調(diào)節(jié)冷調(diào)節(jié)基因的表達[15]。在辣椒研究上，用10 mmolCa2+浸種或直接處理辣椒幼苗葉片，在5℃低溫脅迫下，辣椒幼苗葉片中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（ POD）等保護酶活性提高，可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖等保護性物質(zhì)含量增加，電解質(zhì)滲透率和丙二醛（MDA）含量降低，辣椒耐冷性提高[16-17]。采用CaM抑制劑W7[Ⅳ_（6一氨基己基）-5-氯-1-萘磺胺]浸種處理后，低溫脅迫下辣椒幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸（ Pro）含量下降[18];

1.2 通過脫落酸感知冷信號

越來越多的研究結(jié)果證實，脫落酸（ ABA）、茉莉酸、水楊酸、赤霉素、油菜素內(nèi)酯、細胞分裂素等植物激素參與了植物冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中ABA的作用尤為重要。植物遭受低溫脅迫后，體內(nèi)ABA大量積累，與ABA受體蛋白PYR/PYL/RCAR結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，結(jié)合蛋白磷酸酶2C（ Type 2C proteinphosphatase，PP2C），蛋白激酶OST1（Open stomata1）活性被激活，OST1通過與CBF上游的轉(zhuǎn)錄因子ICE1互作并磷酸化ICEI，從而增加ICEI在低溫條件下的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，最終導(dǎo)致植物抗凍能力增強[19-20]。辣椒低溫脅迫處理研究結(jié)果表明：低溫促進了辣椒葉片中ABA的合成[21];低溫處理中施用外源ABA后，辣椒幼苗中片MDA含量、相對電導(dǎo)率降低，超氧化物歧化酶（ SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性增加，脯氨酸（ Pro）、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量提高，辣椒幼苗耐冷性提高[22-24]。

2 冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

2.1 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一大類轉(zhuǎn)錄因子，通過與下游基因啟動子區(qū)域的CRT/DRE（C—repeat/drought-responsive element， A/GCCGAC）或GCC-box（ AGCCGCC）等順式作用元件結(jié)合調(diào)節(jié)下游基因的表達。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子分為AP2、DREB（ DRE-binding protein）、RAV（ RelatedtoABI3/VPl）和ERF等4個亞家族，DREB亞家族又分為6個亞組（A-I至A-6），其中A-I亞組（C-repeat binding factor/DRE binding factor 1，CBF/DREBI）轉(zhuǎn)錄因子在植物冷信號應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。

在擬南芥中，有3個CBF成員參與冷響應(yīng)，分別為CBF1、CBF2和CBF3[25-27]，在植物冷信號應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用;CBF1、CBF3基因的超量表達也能夠提高作物對干旱、高溫的耐受性[28-29];擬南芥CBF4基因不受低溫誘導(dǎo)[30]，但將擬南芥CBF4基因轉(zhuǎn)入辣椒后，經(jīng)過15℃低溫處理的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為株型緊湊、葉片肥厚平直、葉色濃綠、葉面積增大、SOD和POD活性提高[31]。

辣椒中已經(jīng)鑒定出3個參與冷響應(yīng)的CBF成員，分別為CaCBFla（AY368482）、CaCBFlb（ AY368483）和CfCBF3（HM748942）。辣椒CaCbFla、CaCbFlb和CfCBF3受低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生，且在長期低溫脅迫條件下持續(xù)表達，但當恢復(fù)到25℃時，CaCbFla和CaCbFlb的轉(zhuǎn)錄水平在40 min內(nèi)顯著下降[32-33]。在煙草中過表達CfCBF3，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株中總不飽和脂肪酸的增加，從而減輕低溫脅迫對植株的損傷[33]。研究結(jié)果表明，CaCbFla、CaCbFlb和CfCBF3均通過非ABA依賴途徑參與辣椒的冷響應(yīng)[32-33]。辣椒Ca-DREB’/P/受干旱和鹽害誘導(dǎo)，但不受冷脅迫誘導(dǎo)[34]，其蛋白質(zhì)序列與CaCBFIB的相似度為99.53%，僅在第145位上有1個氨基酸殘基的差異，其與CaCBFIB對冷信號應(yīng)答的差異需要深入研究。

2.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子

WRKY轉(zhuǎn)錄因子至少含有一個與DNA結(jié)合的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由60個氨基酸組成，其N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列。WRKY蛋白通過與啟動子區(qū)域的W-box（ ITGACT/C）結(jié)合來調(diào)節(jié)靶標基因的表達。擬南芥WRKY家族包含74個成員[35]，WRKY34受低溫誘導(dǎo)后在成熟花粉粒中特異表達，wrky34突變體的花粉粒存活率及CBF的表達量都高于野生型，表明存在WRKY34負調(diào)控CBF介導(dǎo)的低溫應(yīng)答途徑[36]。

辣椒WRKY家族包含71個成員，根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)特征分為Group I、GroupII和Group III三類[37]。辣椒CaWRKY1定位于細胞核中，其表達水平在低溫脅迫（4 ℃）下持續(xù)增加，同時還受ABA（ 100μLmol/L）、鹽害（150 mmol/LNaCl）、干旱（150 mmol/L甘露醇）誘導(dǎo);在馬鈴薯中異源表達CaWRKY1，使轉(zhuǎn)基因植株抗旱性增強，同時誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株葉片中CBF3、鋅指蛋白ZATlO、海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白（ LEA）的表達[38]。冷害脅迫下，Ca WRKYIA在短期內(nèi)（3 h）即可被強烈誘導(dǎo)，在24 h達到峰值，同時受鹽脅迫和ABA脅迫上調(diào)，Ca WRKYIA轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐冷性顯著提高[39]。

2.3 NAC轉(zhuǎn)錄因子

NAC（NAM、ATAFl/2和CUC2）轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，N端具有一個保守的約150個氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，含有A、B、C、D和E五個亞結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，具有高度的多樣性。擬南芥和水稻NAC家族分別包含105個和75個成員，根據(jù)預(yù)測蛋白質(zhì)序列的相似性分為I和II兩個大組[40]。擬南芥花粉受低溫脅迫（4℃，48 h）處理后，萌發(fā)率下降到39. 2%，其中5個NAC基因表達上調(diào)，6個NAC基因表達下調(diào)[41]。過量表達SINAC1的轉(zhuǎn)基因番茄植株保持較高水平的PSII最大光化學(xué)效率（Fy/Fm）和放氧活性，比野生型植株具有更好的耐冷性[42]。在煙草中過量表達番茄SINAM1，轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)NtDREB1、NtP5CS和NtERDlOs等與脅迫相關(guān)的基因表達上調(diào)，植株的低溫耐受性增加[43]。

辣椒NAC基因家族包括104個成員，其中CaNAC72和CaNAC27分別與參與多個脅迫響應(yīng)的擬南芥ANAC055和馬鈴薯StNAC30同源，可被鹽害（300 mmol/L NaCl）、干旱（400 mmol/L甘露醇）等誘導(dǎo)，同時可被ABA和茉莉酸甲酯（MejA）誘導(dǎo)[44]。辣椒CaNAC2定位于細胞核并具有轉(zhuǎn)錄激活活性，辣椒P70幼苗葉片中CaNAC2在低溫脅迫（4℃，48 h）下表達水平持續(xù)增加，TRV2-CaNAC2病毒誘導(dǎo)的基因沉默（ VIGS）幼苗植株的冷敏感性增加，CaNAC2同時受鹽害和ABA強烈誘導(dǎo)[45]。

2.4 MYB轉(zhuǎn)錄因子

MYB（ V-myb avian myeloblastosis viral oncogenehomolog）轉(zhuǎn)錄因子在植物中普遍存在，根據(jù)不完全序列重復(fù)（R）結(jié)構(gòu)數(shù)量，分為IR-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB四個亞類[46]。植物MYB基因的數(shù)量較多，擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)196個MYB基因，水稻中有185個[47]。擬南芥MYB15屬于R2R3-Myb家族，在冷脅迫下表達上調(diào)，MYBY15與ICE1相互作用，與CBF基因啟動子中的Myb識別序列結(jié)合;研究結(jié)果表明MYB15是一個負調(diào)節(jié)因子，MYB15的過度表達導(dǎo)致CBF基因的表達減少，植物的耐低溫能力下降[48]。辣椒CaMYB同樣為R2R3-MYB類型，CaMYB的表達受鹽害、干旱、冷害和ABA的誘導(dǎo)，早期還受H202誘導(dǎo)[49]。

3 冷信號下游基因的表達

3.1 冷調(diào)節(jié)基因的表達

COR基因是一類在低溫下快速表達的植物抗寒基因，在啟動子區(qū)域含有順式作用元件DRE/CRT，CBF通過DRE/CRT啟動COR基因的表達，在植物應(yīng)答冷信號中有著重要作用。擬南中COR基因包括COR6.6、COR15a、COR78、COR47 （ LEA II）、HVA1（LEAⅢ）等多個家族[50]。擬南芥COR15a編碼的成熟肽作用于葉綠體的基粒，能降低由結(jié)冰造成的脫水作用對膜的傷害[51]。過量表達COR15a可以提高未經(jīng)低溫馴化的擬南芥葉綠體的耐凍性[52]。

DHN屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（Late embry-ogenesis-abundant proteins，LEA）第2組。已經(jīng)鑒定出7個辣椒CaDHN基因，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分為Yn-SKn和SKn兩種類型，具有DHN家族特有的保守性K結(jié)構(gòu)域和S結(jié)構(gòu)域，受冷害脅迫誘導(dǎo)表達。利用VIGS方法研究發(fā)現(xiàn)CaDHNI和CaDHN3功能缺失植株對冷害耐受性降低，CaDHN1不能被ABA誘導(dǎo)，CaDHN3可被ABA誘導(dǎo)表達[53-54]，說明CaDHN1和CaDHN3盡管為同一基因家族，但通過不同途徑應(yīng)答低溫信號。

3.2 活性氧清除系統(tǒng)基因的表達

在低溫脅迫環(huán)境下，植物通過抗氧化酶和抗氧化物清除細胞內(nèi)的過量活性氧（ ROS），從而避免對植物細胞生物分子產(chǎn)生有害影響。抗氧化酶主要有SOD、CAT、APX等，抗氧化物主要有Pro、谷胱甘肽（ GSH）、抗壞血酸（Vc）等[55]。低溫條件下，辣椒體內(nèi)Vc和GSH含量上升且維持較高的水平，CAT、APX、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）和谷胱甘肽還原酶（GR）活性上升，SOD（ Mn-SOD、FeSOD、CUZnSOD）基因的表達水平未發(fā)生明顯變化[56]。

3.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)基因的表達

海藻糖（Trehalose）是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。植物體內(nèi)海藻糖主要經(jīng)TPS/TPP途徑合成，其中TPS（海藻糖-6-磷酸合成酶）、TPP（海藻糖-6-磷酸磷酸酶）是合成途徑中的關(guān)鍵酶。低溫處理后，辣椒Ca TPS1基因在葉片中大量表達[57]。利用外源0.5 mmol/L海藻糖浸種，可以提高辣椒種子低溫（15 ℃）條件下的發(fā)芽勢和發(fā)芽率[58]。研究結(jié)果表明，海藻糖通過降低細胞膜透性和MDA含量提高辣椒抗寒性，通過提高抗氧化酶活性和減少超微結(jié)構(gòu)損傷而提高辣椒采后果實的耐冷性[59]。對水稻的研究結(jié)果表明，MAPK3磷酸化并維持ICE1的穩(wěn)定，促進了TPP1轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)大量海藻糖產(chǎn)生，從而增強水稻的抗冷能力[60]。這進一步說明植物可以通過多種機制或網(wǎng)絡(luò)應(yīng)答低溫信號。

4 研究展望

現(xiàn)有辣椒耐冷機制研究中，缺少普遍認可的耐冷材料，研究人員多采用雜交一代品種作為試驗材料，由于遺傳背景復(fù)雜，限制了耐冷基因的發(fā)掘和耐冷機制的深入研究。后續(xù)研究需要廣泛搜集辣椒種質(zhì)資源，特別是不同生態(tài)地區(qū)的辣椒材料，鑒定篩選出苗期與成株期耐冷性一致的辣椒材料，用于辣椒耐冷材料的創(chuàng)制及耐冷機制的深入研究。這方面的探索研究已有報道，例如起源于土耳其的辣椒材料20805在低溫弱光下表現(xiàn)出更好的弱光利用能力和更高的光化學(xué)效率[61]，利用耐冷野生甜椒CA157和栽培甜椒CA52創(chuàng)制出耐冷漸滲系CL122[62]。

植物耐冷性由多基因控制，且受AP2/ERF、MYB、WRKY等多個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。在辣椒耐冷性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究方面，只有CBF、WRKY、NAC、MYB等部分轉(zhuǎn)錄因子的表達與功能研究，對其在辣椒冷脅迫響應(yīng)分子機制的研究還十分有限。未來應(yīng)通過深入研究CaCbF1、CaWRKY1、CaNAC2、CaMYB等轉(zhuǎn)錄因子的分子機制，篩選冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，從而進一步完善辣椒應(yīng)答冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

在水稻中，已經(jīng)獲得256個耐冷性相關(guān)的QTL，其中發(fā)芽期70個，芽期29個，苗期98個，生殖生長期59個[63]。這也說明植物耐冷性是受多個基因控制的復(fù)雜性狀，可能在同一個發(fā)育時期耐冷性受多個耐冷QTL控制，在不同發(fā)育時期則分別受不同耐冷QTL控制。在辣椒溫度敏感相關(guān)QTL定位研究中，以溫度敏感突變體C，chinense cv. sy-2（低于20oC即表現(xiàn)為皺葉）為材料，在l號染色體定位到1個QTL，獲得2個候選基因ORFlO和ORF20，預(yù)測編碼F-box蛋白[64]。在辣椒實際生產(chǎn)中，冷害對辣椒成株期產(chǎn)量形成的影響要大于對苗期的影響，辣椒發(fā)芽期、苗期、特別是成株期耐冷性相關(guān)QTL定位及相關(guān)基因的發(fā)掘需要深入研究。

辣椒有5個栽培種和22個野生種[65]。生產(chǎn)用商業(yè)品種育種材料主要來源于一年生種（C.annu-um），遺傳背景狹窄，因此應(yīng)加大辣椒種間雜交、胚拯救等技術(shù)的研究，發(fā)掘利用其他栽培種和野生種中的耐冷基因。辣椒屬于組織培養(yǎng)頑拗型植物，目前仍缺乏高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，且遺傳轉(zhuǎn)化效率嚴重依賴于基因型，研究者應(yīng)加大非組織培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究力度，以用于冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵基因的功能驗證。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)正在快速發(fā)展，已經(jīng)在擬南芥、煙草、大豆、番茄、馬鈴薯、水稻、小麥、玉米等作物中得到應(yīng)用。在辣椒研究中應(yīng)用基因組編輯技術(shù)，將對辣椒耐冷材料創(chuàng)制和冷信號應(yīng)答機制研究十分有利，對辣椒育種工作同樣具有重要意義。

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（責任編輯：張震林）