王芝涵 王春偉 高海馨 荊琦 余廷濠 王燕

摘要：針對(duì)引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌（ Fusarium graminearum），根據(jù)翻譯延伸因子基因（EF-1alpha）的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間和溫度，建立一種靈敏、快速的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（ LAMP）檢測(cè)方法，并對(duì)優(yōu)化的F graminearum LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行特異性、靈敏度及可行性檢測(cè)。結(jié)果表明，該LAMP方法能夠有效檢測(cè)禾谷鐮刀菌的基因組DNA，64℃、45 min為最優(yōu)反應(yīng)條件。在最佳條件下，該方法對(duì)禾谷鐮刀菌具有良好的特異性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到100 pg/μl。該檢測(cè)方法為禾谷鐮刀菌引起的玉米穗腐病的田間快速診斷及病原菌監(jiān)測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌;翻譯延伸因子基因;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;分子檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S432.4+4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（ 2019） 03-0581-05玉米穗腐病是玉米最常見(jiàn)的病害之一，在中國(guó)玉米種植區(qū)普遍發(fā)生，發(fā)病率為5% - 10%，感病品種的發(fā)病率高達(dá)50%，個(gè)別地塊嚴(yán)重時(shí)可達(dá)100% [1-2]，造成了巨大的損失。玉米穗腐病由多種病原菌侵染所致，鐮刀菌為主要病原菌[3]，而且鐮刀菌在致病過(guò)程中能產(chǎn)生多種毒素（如赤霉烯酮、單端孢霉毒素、串珠鐮刀菌素和伏馬菌素等），可促使細(xì)胞凋亡，對(duì)動(dòng)植物機(jī)體造成多種病理?yè)p傷，給人類的食物安全帶來(lái)嚴(yán)重隱患[4]。目前，已報(bào)道的引起玉米穗腐病的鐮刀菌有15種以上[5]，其中禾谷鐮刀菌[6-7]為優(yōu)勢(shì)種群。鐮刀菌形態(tài)具有多型性和變異性，僅依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行病原菌的準(zhǔn)確鑒定具有較大難度[8]，并且傳統(tǒng)鑒定方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作量大、結(jié)果不準(zhǔn)確等問(wèn)題[9]。因此，及時(shí)、有效地對(duì)鐮刀菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，是防止其寄主植物病害發(fā)生，保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的基礎(chǔ)。

目前，對(duì)病原菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等[10-11]，這些方法不僅操作繁雜、費(fèi)時(shí)、準(zhǔn)確度低，還易遺漏潛育期或隱癥的病原菌，導(dǎo)致病害暴發(fā)。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法已不能滿足現(xiàn)代植物病理學(xué)研究的需要，建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)玉米穗腐病的防控具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是日本學(xué)者Notomi在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型體外核酸擴(kuò)增方法[12]，隨著IAMP的優(yōu)點(diǎn)逐漸為研究者所熟知[13-16]，將該技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)各種病原體的同時(shí)，研究者們也對(duì)該技術(shù)提出了很多改進(jìn)建議，使得該技術(shù)逐步完善，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌或病毒的定性定量檢測(cè)、臨床疾病診斷以及動(dòng)植物中致病微生物檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域[17]。

本研究擬利用LAMP技術(shù)，針對(duì)翻譯延伸因子基因（EF-1alpha]的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立禾谷鐮刀菌的IAMP快速分子檢測(cè)體系，以期為玉米穗腐病的病原監(jiān)測(cè)及病害防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2016年采集到玉米穗腐病樣品，從中分離獲得禾谷鐮刀菌（Fusarium gramznearum），以及實(shí)驗(yàn)室保存的層出鐮刀菌（F.proliferatum）、木賊鐮刀菌（F.equiseti、銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、輪枝鐮刀菌（F.verticillioide）、半裸鐮刀菌（F.semitectum）、磚紅鐮刀菌（F.lateritium）、燕麥鐮刀菌（P avenaceum）、變紅鐮刀菌（F incar-natum）、藤倉(cāng)鐮刀菌（F.fujikuroi）、枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）、灰葡萄孢（Botrytisci一nerea）、擬盤多毛孢（Pestalotiopsis）。以上菌株均保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂糖培養(yǎng)基（PDA）試管斜面，置于4℃冰箱中。

1.2 試劑及儀器

Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，6×Loading buffer，DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，LAMP PCR Master Mix反應(yīng)液、10×Tris-Tricncme緩沖液、4S Green核酸染色劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

SANYO超凈工作臺(tái)、Eppendorf PCR儀、Eppendorf超低溫高速離心機(jī)、制冰機(jī)、電泳儀、Nanodr0 2000微量分光光度計(jì)、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)、Thermo超純水儀、紫外分光光度計(jì)、OLYMPUSDP72光學(xué)數(shù)字顯微鏡、SANYO超低溫菌種保存柜和人工氣候箱由植物病理學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 LAMP引物篩選

通過(guò)測(cè)定禾谷鐮刀菌（F graminearum）的EF-lalpha保守區(qū)域堿基序列，使用Clustal X軟件對(duì)鐮刀屬及其他病原菌不同種間EF-1alpha基因堿基序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用Primer Explorer V5軟件設(shè)計(jì)出一套引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP檢測(cè)引物組合，由1對(duì)外側(cè)引物（ F3/B3）、l對(duì)內(nèi)側(cè)引物（ FIP/BIP）和1對(duì)環(huán)引物（Loop F/Loop B）組成。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用ddH，0溶解后分裝，保存于4℃冰箱中備用。引物序列如表1顯示。

1.4 DNA提取

采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取14種菌株的DNA。以ddH20作為空白對(duì)照。

1.5 LAMP體系優(yōu)化

反應(yīng)體系為25.0μl： 12.5μl 2x Lamp MasterMix，10.0 μmol/L內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各2.0μl，10.0μmol/L外側(cè)引物F3和B3各0.5μl，10.0μmol/L環(huán)引物L(fēng)oopB和Loop F各1.0μl，1.0μl TemplateDNA， 0.5μl DNA Polymerase， 4.0μl SterilizedddH20。將反應(yīng)溶液混勻，放人恒溫水浴鍋，對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)束后觀察2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

瓊脂糖凝膠電泳圖觀察：稱取0.7 9瓊脂糖，加35.0 ml TAE緩沖液，用微波爐加熱1.5 min后加入6.5μl染色劑。取5.0μl LAMP產(chǎn)物與6×Loadingbuffer混勻染色，在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，若有亮條帶出現(xiàn)，則表明擴(kuò)增產(chǎn)物存在。

1.6 LAMP檢測(cè)方法的靈敏度

用DNA質(zhì)量濃度測(cè)定儀測(cè)定玉米禾谷鐮刀菌DNA質(zhì)量濃度。將DNA質(zhì)量濃度依次稀釋，使得質(zhì)量濃度梯度依次為10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl，分別取2.Oμl作為L(zhǎng)AMP檢測(cè)方法的反應(yīng)模板，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后觀察結(jié)果，確定LAMP檢測(cè)方法的靈敏度。

1.7 LAMP檢測(cè)方法的特異性

將上述14種供試菌株的基因組DNA進(jìn)行IAMP擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后觀察IAMP反應(yīng)的特異性結(jié)果。

選用健康的玉米籽粒，先在實(shí)驗(yàn)室的無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行消毒處理，用2%的次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡2 min，無(wú)菌水沖洗、晾干。再用接種針在籽粒上刺約3 mmx2 mm（深×寬）的傷口，傷口晾干后接種禾谷鐮刀菌孢子懸浮液（1 ml lx10個(gè)孢子）10μl。籽粒晾干后用滅菌保鮮膜包裹，貯藏于20℃培養(yǎng)箱中，并保持95%左右的相對(duì)濕度。

采集田間發(fā)生玉米穗腐病的玉米籽粒和人工接種禾谷鐮刀菌發(fā)病的玉米籽粒，從每份樣品中挑取100 mg鮮組織，用NaOH快速裂解法提取DNA[18]，作為模板用于LAMP擴(kuò)增，以上處理重復(fù)3次。以玉米穗腐病禾谷鐮刀菌純DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以空白PDA平板接種健康玉米基因組DNA作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

為了探索IAMP的最佳反應(yīng)溫度，從61- 65℃進(jìn)行LAMP檢測(cè)，反應(yīng)時(shí)間60 min，反應(yīng)結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選取最清晰條帶所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)溫度。結(jié)果（圖1）表明，61-65℃條件下均能進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)溫度為64℃時(shí)條帶最清晰。

2.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

為了明確LAMP檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)時(shí)間，在64℃的反應(yīng)溫度下，分別在15 min、30 min、45 min、60 min、75 min條件下進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果（圖2）表明，反應(yīng)時(shí)間為45 min時(shí)，便可觀察到清晰條帶，符合快速檢測(cè)的要求。

2.3 LAMP檢驗(yàn)方法的靈敏度

對(duì)提取的禾谷鐮刀菌基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，結(jié)果（圖3）顯示，質(zhì)量濃度為100 pg/μI仍能看見(jiàn)清晰條帶，表明該體系檢測(cè)靈敏度高。

2.4 LAMP引物的特異性

對(duì)14種供試菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果（圖4）表明，禾谷鐮刀菌在電泳后可觀察到明亮的條帶，而其他供試菌株電泳后未觀察到清晰的梯形條帶。說(shuō)明，該體系對(duì)禾谷鐮刀菌具有很好的特異性。

2.5 發(fā)病組織的LAMP檢測(cè)

使用優(yōu)化之后的LAMP反應(yīng)體系，對(duì)禾谷鐮刀菌純DNA（陽(yáng)性對(duì)照）、人工接種禾谷鐮刀菌發(fā)病籽粒DNA樣品、采集的田間發(fā)病籽粒DNA樣品、健康籽粒的DNA樣品和空白PDA平板接種的玉米基因組DNA（陰性對(duì)照）進(jìn)行LAMP快速檢測(cè)。結(jié)果（圖5）表明，陽(yáng)性對(duì)照、人工接種禾谷鐮刀菌發(fā)病籽粒DNA樣品、田間發(fā)病籽粒DNA樣品的2%瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰，而健康籽粒的DNA樣品和陰性對(duì)照未檢測(cè)到清晰條帶。

3 討論

在中國(guó)，玉米穗腐病病原菌的種類多[19]，其中禾谷鐮刀菌（F.graminearum）是引起玉米穗腐病的主要病原菌[3]，對(duì)玉米的危害較大。目前，PCR方法已經(jīng)成功用于玉米穗腐病病原菌的檢測(cè)20-22]。史亞娟等20]建立了禾谷鐮刀菌和擬輪枝鐮孢菌的快速和定量檢測(cè)體系，劉金華等[21]應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)玉米中的禾谷鐮刀菌，焦鑄錦等[22]建立鐮刀菌基因敲除體系，同源重組核酸片段的PCR轉(zhuǎn)化過(guò)程需要2-3 h。由于普通PCR反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作人員、操作環(huán)境和儀器設(shè)備的要求高，因此，目前需要建立一種安全、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法。

雙重PCR檢測(cè)體系中，DNA模板的檢測(cè)靈敏度為6. 25 ng/μl，低于傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，能夠滿足快速檢測(cè)的要求[20]。本研究基于玉米穗腐病禾谷鐮刀菌建立了IAMP快速檢測(cè)方法，靈敏度為100 P9/μl，但是由于IAMP的靈敏性較高，容易造成假陽(yáng)性現(xiàn)象，因此需要對(duì)試驗(yàn)器材進(jìn)行定期消毒處理，并采用不同的移液器操作，以避免交叉感染。影響IAMP反應(yīng)的因素很多，反應(yīng)體系中的每個(gè)參數(shù)都可能會(huì)影響最終的結(jié)果。

引物是否具有特異性是決定IAMP檢測(cè)方法成敗的關(guān)鍵?，F(xiàn)階段，用于鑒定和檢測(cè)禾谷鐮刀菌的靶標(biāo)中，核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域基因（ITS）是最常用的靶標(biāo)，但對(duì)于一些近似種，其ITS區(qū)域同源性相對(duì)較高，很難設(shè)計(jì)出特異性引物[23]。EF-1alpha基因的保守區(qū)域具有足夠多的特異性位點(diǎn)，并且其序列在種內(nèi)相對(duì)保守，非常適合作為禾谷鐮刀菌的分子檢測(cè)靶標(biāo)[24-25]。因此，本研究選擇EF-1alpha基因作為禾谷鐮刀菌特異性檢測(cè)的靶標(biāo)基因。LAMP引物的設(shè)計(jì)和篩選有其獨(dú)特的原則及規(guī)律，利用Primer Explorer V5軟件，設(shè)計(jì)出一套引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP檢測(cè)引物組合。LAMP反應(yīng)中內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3的特異性決定了反應(yīng)的特異性。對(duì)供試菌株基因組DNA進(jìn)行IAMP特異性分析，檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMP體系只對(duì)禾谷鐮刀菌表現(xiàn)出良好的特異性。段亞冰等[26]通過(guò)人工接種禾谷鐮刀菌，檢測(cè)LAMP反應(yīng)體系在小麥赤霉病對(duì)多菌靈抗藥性檢測(cè)應(yīng)用中的可靠性。在本試驗(yàn)中，為了提高LAMP檢測(cè)特異性的可靠性，對(duì)采集的田間發(fā)生玉米穗腐病的玉米籽粒樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示出良好的特異性。

LAMP快速檢測(cè)方法具有普通PCR所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，它操作簡(jiǎn)便，檢出效率高，用時(shí)短，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，更適合在基層推廣應(yīng)用[27-28]。同時(shí)，可結(jié)合NaOH快速提取DNA技術(shù)，使玉米穗腐病檢測(cè)方法在田間應(yīng)用成為可能。該體系為田間玉米穗腐病病原的快速檢測(cè)和病害防治工作奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：王妮）