劉蓓一 宦海琳 顧洪如 許能祥 沈琴 丁成龍

摘要：本試驗(yàn)旨在闡明不同發(fā)酵時(shí)期大麥青貯發(fā)酵品質(zhì)及細(xì)菌多樣性的動(dòng)態(tài)變化。試驗(yàn)分別在青貯第2d、青貯第14 d、青貯第60 d和有氧暴露第Sd采樣，對青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)成分等進(jìn)行測定，并采用Miseq高通量測序技術(shù)分析細(xì)菌的多樣性和組成。結(jié)果表明，與青貯第2d相比，大麥青貯第60 d的pH值顯著下降（P<0.05），乳酸含量顯著升高（P<0.05）。青貯第2 d的細(xì)菌優(yōu)勢菌群是魏斯氏菌屬（Weissella）和乳桿菌屬（Lactobacil-lus），相對豐度分別為45. 960%、30. 680%。青貯第14 d的細(xì)菌優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus），相對豐度為74.720%，其次是魏斯氏菌屬（Weissella），相對豐度為13.170%。青貯第60 d的細(xì)菌優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（Lactoba-cillus），相對豐度為96.740%。有氧暴露第5d乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度為0.710%，有氧暴露后滋生了不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter]、沙雷氏菌屬（Serratia）等有害菌。綜上所述，青貯第2-60 d大麥青貯的優(yōu)勢菌群是乳桿菌屬，而有氧暴露后菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，不動(dòng)桿菌屬、沙雷氏菌屬等有害菌的相對豐度增加。

關(guān)鍵詞：青貯品質(zhì);大麥青貯;Miseq高通量測序;細(xì)菌菌群

中圖分類號： S512.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號： 1000-4440（2019）03-0653-08

大麥?zhǔn)侵饕墓阮愖魑镏唬蚓哂锌鼓嫘詮?qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)而被廣泛種植。大麥?zhǔn)侵匾募Z飼兼用作物之一，其籽粒是畜禽的精飼料，蛋白質(zhì)含量顯著高于玉米，而淀粉含量比玉米略低。目前，草食家畜的優(yōu)質(zhì)粗飼料極度缺乏，豐富的水溶性碳水化合物和適宜的水含量是制作優(yōu)質(zhì)青貯飼料的基礎(chǔ)。大麥的水溶性碳水化合物含量較高，可以為乳酸鹽生產(chǎn)提供充足的底物，所以全株大麥適宜青貯，從而為革食家畜提供優(yōu)質(zhì)的冬季粗飼料[1]。

在開窖、取料和飼喂過程中，青貯飼料與外部空氣頻繁接觸，容易通過二次發(fā)酵導(dǎo)致有氧腐敗[2]。在二次發(fā)酵過程中，會(huì)產(chǎn)生大量腐敗菌，造成飼料營養(yǎng)成分喪失，進(jìn)而影響動(dòng)物生產(chǎn)性能[3]。田靜等[4]研究發(fā)現(xiàn)，大麥青貯過程中添加植物乳桿菌（Lacto-bacillus plantarum）可以顯著增加青貯飼料的乳酸含量，降低pH值，提高大麥青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，添加類谷糠乳桿菌（Lactobacillus parafarraqinis）ZH1可以提高大麥抽穗期和開花期青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，且有效提高其有氧穩(wěn)定性。Kim等[5]指出，植物乳桿菌和丙酸都能減少酵母菌的數(shù)量，從而減少有氧腐敗。

青貯過程是一個(gè)復(fù)雜的微生物發(fā)酵體系，有多種微生物參與，且不同種類微生物對青貯飼料品質(zhì)的影響不同[6]。因此，全面了解大麥青貯期間和有氧暴露后微生物菌群組成及主要有害菌種類，才能更好地防止有氧腐敗。目前，采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法從青貯飼料中已分離鑒定出的微生物主要有乳酸菌、酵母菌、霉菌等[7-8]。但是傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法只能分離到約1%的環(huán)境微生物，無法真正完全了解微生物的組成，而且傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時(shí)長，操作復(fù)雜[9]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA克隆建庫、變性梯度凝膠電泳技術(shù)（ PCR-DGGE）、限制性片段長度多樣性（T—RFLP）等非培養(yǎng)方法被廣泛應(yīng)用于青貯飼料微生物多樣性的研究中[10-12]，但是這些技術(shù)鑒定到的優(yōu)勢物種不夠全面[13]。采用高通量測序技術(shù)直接從樣品中提取DNA，能完整地分析樣品全貌并且最大限度地展示樣品中的微生物種類和豐度[14]，揭示青貯飼料中有益菌和有害菌的種類。Zheng等[15]利用高通量測序技術(shù)研究添加乳酸菌和蔗糖對苜蓿青貯過程中微生物菌群的影響，發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌和蔗糖可以阻止梭菌定殖，而未添加組的優(yōu)勢菌群是產(chǎn)氣莢膜梭菌、硫酸鹽還原菌和巴氏梭菌。劉晶晶[16]用高通量測序技術(shù)研究不同乳酸菌添加劑對柳枝稷青貯微生物多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)接種復(fù)合乳酸菌可以降低青貯飼料的細(xì)菌群落多樣性，有效抑制腸桿菌屬細(xì)菌的相對豐度，提高乳桿菌屬細(xì)菌的相對豐度。然而，高通量測序技術(shù)在青貯飼料方面應(yīng)用的報(bào)道較少。

本試驗(yàn)擬利用Miseq高通量測序技術(shù)與常規(guī)發(fā)酵品質(zhì)分析相結(jié)合的方法，研究大麥青貯過程中不同發(fā)酵時(shí)期的青貯品質(zhì)、營養(yǎng)成分及微生物多樣性，監(jiān)測微生物菌群組成的動(dòng)態(tài)變化，為添加劑的安全使用和發(fā)酵調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和樣品采集

2017年5月，在大豐區(qū)眾鑫農(nóng)機(jī)服務(wù)專業(yè)合作社基地采集試驗(yàn)樣品（全株大麥），切割為1-2 cm大小的青貯原料，通過微波干燥，計(jì)算其中的水分含量，在其水分含量為70%時(shí)開始青貯。裝入聚乙烯包裝袋內(nèi)，每袋500g，用真空封口機(jī)（DZQ-400/2D，上?？嫡b機(jī)械有限公司產(chǎn)品）封口，封口后置于室溫下避光保存。分別在青貯第2d、青貯第14 d、青貯第60 d采樣，樣品分別標(biāo)記為D2、D14、D60，D2和D14各取3袋，而D60取6袋，其中3袋用作青貯第60 d樣品的分析，另外3袋青貯飼料開啟后，將其混勻后置入IL聚乙烯罐中，罐口用雙層紗布包裹，防止蒼蠅等污染和水分散失.空氣可自由進(jìn)入罐中，置于室溫條件下保存，有氧暴露后第5 d（A5）進(jìn)行取樣。取每袋的中間部位作為樣品，其中一部分凍存于50 ml的無菌離心管中，-80℃保存，主要進(jìn)行后期微生物多樣性檢測;一部分裝入封口袋于-20 ℃條件下保存，進(jìn)行發(fā)酵品質(zhì)測定;另外一部分（約10 g）用于微生物（包括乳酸菌、酵母菌、好氧細(xì)菌）數(shù)量的計(jì)數(shù)。剩余青貯飼料用于營養(yǎng)成分的測定。

1.2 青貯樣品發(fā)酵品質(zhì)及微生物數(shù)量的測定

分別于4個(gè)不同青貯階段取20 g大麥青貯樣品，加入180 ml蒸餾水充分混勻，通過搗碎機(jī)攪拌lmm，采用4層紗布和定性濾紙進(jìn)行過濾，獲得浸出液，于-20℃冰箱中保存待測，測定pH值，以及乳酸、乙酸、丙酸和乙醇的含量。pH值用MettlerToledo型pH計(jì)測定，乳酸、乙酸、丙酸、乙醇采用安捷倫1260高效液相檢測系統(tǒng)測定，配備示差檢測器和Carbomix@ H-NP;色譜性，流動(dòng)相為2.5 mmol/LH2S04，流速為0.5 ml/min，溫度為55℃。

取10g樣品，置于無菌三角瓶內(nèi)，并注入無菌生理鹽水，共計(jì)90 ml，密封處理，搖床搖晃2h，速度為120 r/min。單層無菌紗布過濾，進(jìn)行逐級稀釋，稀釋梯度的懸浮液于MRS（ De Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基中，在37℃厭氧的環(huán)境中培養(yǎng)2d，計(jì)算乳酸菌數(shù)量。將懸浮液接種于葡萄糖麥芽浸膏培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)ld，計(jì)算酵母菌數(shù)量。將懸浮液接種于牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基中，于30 ℃下培養(yǎng)ld，計(jì)算好氧細(xì)菌數(shù)量。

將剩余部分的青貯飼料收集起來烘干稱質(zhì)量，測定干物質(zhì)的含量。55℃烘箱中干燥48 h至恒定質(zhì)量，測定干物質(zhì)含量，采用范氏洗滌纖維法測定中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量。

1.3 青貯飼料微生物高通量測序

1.3.1 微生物基因組DNA的提取取青貯飼料樣品10 g，注入90 ml無菌生理鹽水，密封，120 r/min搖床搖2h。單層紗布過濾雜質(zhì)，12 000 g離心15mm收集細(xì)菌菌體，然后利用PowerSoil DNAIsolation Kit試劑盒提取青貯飼料菌群的總DNA。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增使用細(xì)菌16S rRNA基因V3 - V4區(qū)引物對獲得的DNA模板進(jìn)行序列擴(kuò)增。引物序列為F（5 '-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和R（5，-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT_3 7）.PCR反應(yīng)體系為50μl，包括5.0μl的SxPCR buffer，4.0¨l的dNTPs，0.3¨l的FastPfu DNA polymerase，30 ng模板DNA，2.0μl正向引物F（10 μmol/L），2.0μl的反向引物R（ 10μmol/L），采用ddH70補(bǔ)充到50μ1。PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s，56oC退火30 s，72℃延伸40 s，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為25次，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 測序PCR產(chǎn)物的濃度及目的條帶采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在其濃度適宜和條帶準(zhǔn)確的情況下，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3.4 生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)分析使用Cutadapt（ V1.9.1）軟件先對Reads進(jìn)行低質(zhì)量剪切，基于Barcode對其樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，同時(shí)去除引物序列和Bar-code，獲取原始數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上，與物種注釋數(shù)據(jù)庫比對，進(jìn)行嵌合體序列檢測，使用UCHIME軟件剔除嵌合體，獲取有效數(shù)據(jù)。

通過Uparse軟件對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，以97%的一致性將其聚類成為操作分類單元（OTUs），采用高頻次出現(xiàn)的序列作為代表序列[17]。在此基礎(chǔ)上，對選出來的代表序列進(jìn)行物種注釋，完成物種注釋后，采用Mothur方法將其與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，從而可以得到分類學(xué)信息以及基于不同分類水平的菌群組成。利用QIIME軟件對OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析[18]。細(xì)菌16S rRNA基因V3 - V4區(qū)采用Sliva細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。物種注釋和豐度分析基于RDP classifier算法在QIIME平臺(tái)軟件上進(jìn)行，通常在其置信度水平為90%的條件下進(jìn)行[19]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)獲取數(shù)據(jù)信息，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)比較采用方差分析，多重比較采用Duncan's法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時(shí)期大麥青貯品質(zhì)和微生物數(shù)量的變化

表1顯示，大麥青貯第2d的pH最高，經(jīng)過60 d的青貯發(fā)酵，pH值顯著下降（P<0.05），但有氧暴露第5 d，pH值顯著上升，達(dá)到6.02+0.18（ P

表2顯示，青貯第2d大麥干物質(zhì)含量最高，顯著高于青貯第14 d和青貯第60 d（P

2.3 不同發(fā)酵時(shí)期大麥青貯細(xì)菌的多樣性分析計(jì)算菌群豐度的指數(shù)有Chao指數(shù)、Ace指數(shù)，其數(shù)值越大，表示菌群豐度越高。表3顯示，青貯第2d的細(xì)菌Chao指數(shù)和Ace指數(shù)最高，青貯第60 d時(shí)最低。有氧暴露第5d的細(xì)菌Chao指數(shù)和Ace指數(shù)均高于青貯第60 d。Shannon指數(shù)是用來計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)，Shannon指數(shù)越大，菌群多樣性越高。青貯第2- 60 d，隨著青貯時(shí)間的延長，細(xì)菌Shannon指數(shù)降低，但是有氧暴露第5d的Shannon指數(shù)增加，說明青貯第60 d時(shí)細(xì)菌多樣性最低，有氧暴露會(huì)使細(xì)菌多樣性增加。

2.4 不同發(fā)酵時(shí)期大麥青貯細(xì)菌菌群的主成分分析

由細(xì)菌菌群的主成分分析（圖1）可知，青貯第2d與青貯第14 d細(xì)菌菌群的距離較為接近，表明二者在微生物組成上差異不大，青貯第60 d與青貯第2d、青貯第14 d的細(xì)菌菌群距離較遠(yuǎn)，存在一定差異，有氧暴露第Sd與其他3個(gè)取樣時(shí)間的細(xì)菌菌群距離也較遠(yuǎn)。

2.5 不同發(fā)酵時(shí)期大麥青貯細(xì)菌菌群的組成變化

2.5.1 基于門水平的細(xì)菌茵群結(jié)構(gòu)分析 表4顯示，相對豐度大于1%的門有厚壁菌門（ Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（ Bacteroidetes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）等。青貯第2d的主要優(yōu)勢菌群為厚壁菌門、變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門，相對豐度分別為81.443%、3.702%、7.420%，總相對豐度為92.565%。青貯第14 d的主要優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（ 95.103%），其次是藍(lán)細(xì)菌門（1.040%），變形菌門（0.877%），總相對豐度為97.020%。青貯第60 d的主要優(yōu)勢菌群為厚壁菌門，相對豐度為99.500%。有氧暴露第5d的主要優(yōu)勢菌群為厚壁菌門和變形菌門，相對豐度分別為34.278%和45.110%.其次是擬桿菌門（13.090%），總相對豐度為92. 482%。門水平上，在大麥青貯第2-60 d厚壁菌門（Firmicutes）細(xì)菌始終占優(yōu)勢地位，隨著青貯時(shí)間的延長，厚壁菌門細(xì)菌相對豐度呈增長趨勢，但是與青貯第60 d相比，有氧暴露第5d的厚壁菌門細(xì)菌相對豐度下降，變形菌門和擬桿菌門細(xì)菌相對豐度增加。

2.5.2 基于屬水平的細(xì)菌茵群結(jié)構(gòu)分析表4顯示了在屬水平上不同發(fā)酵時(shí)期大麥青貯細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化。青貯第2d的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella），其相對豐度分別為30. 6800-/0和45. 960%。青貯第14 d的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus），相對豐度為74. 720%，其次是魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（ Pediococcus），相對豐度分別為13. 170%和7. 210%。青貯第60 d優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacitlus），相對豐度為96. 740%，其次是魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）.相對豐度分別為1. 400%和1.3600-/0。有氧暴露第Sd，乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度僅占0.710%，而不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、普羅維登斯菌屬（Providencia）、穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）和沙雷氏菌屬（Serratia）的相對豐度分別為26.540%、33.220%、16.400%、13.090%、2.170%。

青貯第2d、青貯第14 d、青貯第60 d乳桿菌屬的相對豐度分別是30. 680%、74.720%、96.740%，即隨著青貯時(shí)間的延長，乳桿菌屬相對豐度增加，于青貯第60 d達(dá)到了峰值。但是有氧暴露第5d乳桿菌屬的相對豐度僅有0.710%，被不動(dòng)桿菌屬、腸球菌屬、普羅維登斯菌屬、穩(wěn)桿菌屬所取代。說明，青貯第2-60 d大麥青貯的優(yōu)勢菌群是乳桿菌屬，而有氧暴露后菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，不動(dòng)桿菌屬、沙雷氏菌屬等有害菌的相對豐度增加。

3 討論

3.1 不同發(fā)酵時(shí)期大麥青貯的發(fā)酵參數(shù)和微生物數(shù)量變化

大麥?zhǔn)侵袊饕那噘A原料之一。本試驗(yàn)在大麥青貯第2d、第14 d、第60 d取樣，發(fā)現(xiàn)青貯飼料感官品質(zhì)良好，無霉變和黏手現(xiàn)象，有酒酸香味，無臭味。但是在有氧暴露第Sd時(shí)，感官品質(zhì)變差，有霉變現(xiàn)象。pH作為評判青貯成功的重要指標(biāo)，pH值小于4.0時(shí)，青貯飼料品質(zhì)優(yōu)等，pH值為4.1-4.3，青貯飼料品質(zhì)良好，pH值為4.4-5.0，青貯飼料品質(zhì)一般，pH值在5.0以上，青貯飼料品質(zhì)劣等[20]。試驗(yàn)中，青貯第60 d的pH值達(dá)3.94+0.01，屬于品質(zhì)優(yōu)等，而有氧暴露Sd時(shí)pH值達(dá)6.02+0.18，品質(zhì)劣等，即有氧暴露導(dǎo)致大麥青貯的有氧腐敗，降低了青貯品質(zhì)，這與萬學(xué)瑞等21]報(bào)道的結(jié)果一致。在有氧條件下，隨著暴露時(shí)間的增加，pH值相應(yīng)增加，這主要是由好氧性微生物增殖導(dǎo)致的[22]。青貯過程較為復(fù)雜，乳酸菌是青貯發(fā)酵過程中關(guān)鍵的微生物[23]，乳酸菌能否迅速大量繁殖決定著青貯的成敗。青貯第2-60 d，隨著青貯時(shí)間的延長，乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，有氧暴露第5d的乳酸菌數(shù)量最低。有氧條件下，大麥青貯容易發(fā)生二次有氧發(fā)酵，導(dǎo)致內(nèi)部的酵母菌和好氧細(xì)菌迅速增殖，抑制乳酸菌的生長，引起青貯飼料變質(zhì)。有學(xué)者認(rèn)為，酵母菌和霉菌是導(dǎo)致青貯二次發(fā)酵過程中營養(yǎng)損失的主要原因，這是因?yàn)榻湍妇兔咕群醚跷⑸锟梢匝趸噘A有機(jī)酸，從而引起青貯飼料的有氧變質(zhì)[24]。本研究中，有氧暴露第5d，酵母菌和好氧細(xì)菌數(shù)量顯著高于青貯第14 d和第60 d。因此，為提高大麥青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性，大麥青貯時(shí)應(yīng)使用能提高有氧穩(wěn)定性的添加劑。

3.2 大麥青貯細(xì)菌多樣性的動(dòng)態(tài)變化

青貯飼料為復(fù)雜的微生物體系，在整個(gè)青貯過程中，有多種微生物參與，主要有原料附著微生物、發(fā)酵微生物和腐敗變質(zhì)微生物[25]，因此研究微生物的菌群結(jié)構(gòu)十分重要。本研究通過MiSeq高通量測序發(fā)現(xiàn)，大麥青貯期絕對優(yōu)勢菌門為厚壁菌門。Eikmeyer等[26]利用NGS高通量測序技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門是優(yōu)勢菌，在青貯第14 d和第58d厚壁菌門的相對豐度分別為86.000%、87.000%。厚壁菌門中包括產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)芽孢和支原體菌群，且大部分具有降解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉等大分子化合物的作用[27]。厚壁菌門和變形菌門是苜蓿青貯飼料中主要的優(yōu)勢菌門[13]。本研究中，有氧暴露第5d的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門和變形菌門，相對豐度分別為34. 278%和45. 110%。變形菌門為細(xì)菌中最大的門，包括大腸桿菌、弧菌和螺桿菌等，另外歐文氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬等也屬于變形菌門[28]。本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對不同發(fā)酵時(shí)期大麥青貯的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)青貯第2d、第14 d、第60 d乳桿菌屬占絕對優(yōu)勢，其相對豐度分別是30. 680%、74.720%、96.740%，即相對豐度隨著青貯時(shí)間的延長呈增加趨勢，在青貯第60 d達(dá)到峰值，這與胡宗福等[29]的研究結(jié)果一致。Ennahar等[30]發(fā)現(xiàn)，青貯飼料發(fā)酵初期主要的優(yōu)勢菌群為片球菌，從植物原料到青貯飼料，糞鏈球菌和腸膜明串珠菌在開始階段發(fā)揮作用，隨后被乳桿菌、短乳桿菌和布氏乳桿菌等更耐酸的乳酸菌代替。乳桿菌屬是青貯穩(wěn)定期的主要菌群[31]，為青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的提升提供了菌群保障。本研究中，在青貯第2d，魏斯氏菌屬也是優(yōu)勢菌群，相對豐度為45.960%，青貯第14 d時(shí)，相對豐度為13.170%，到青貯第60 d時(shí)，其相對豐度僅為1. 400%，說明在青貯初期，魏斯氏菌屬具有重要作用，在青貯后期其作用明顯減退，這與陶蓮等[32]的研究結(jié)果一致。

不動(dòng)桿菌是一種需氧的非發(fā)酵細(xì)菌，廣泛存在于水體、土壤等外界環(huán)境中，而在青貯飼料中很少發(fā)現(xiàn)。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有氧暴露第5d，大麥青貯中不動(dòng)桿菌屬的相對豐度達(dá)到26.540%，此時(shí)pH值為6.02+0.18。青貯第14 d、第60 d青貯飼料中幾乎不含不動(dòng)桿菌屬，這2個(gè)階段青貯飼料的pH值都在3.96以下，即青貯飼料的pH值低于3.96時(shí)，不利于不動(dòng)桿菌屬生長，這與Li等[33]報(bào)道的結(jié)果一致。Liu等[34]指出，青貯飼料開袋后，玉米秸稈青貯飼料好氧細(xì)菌主要由香味類香味菌、不動(dòng)桿菌、嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌、嗜線蟲沙雷氏菌、短小芽孢桿菌和紡錘型賴氨酸芽孢桿菌組成，推測玉米秸稈青貯有氧變質(zhì)可能是由這些好氧細(xì)菌引起的。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，有氧暴露后好氧細(xì)菌數(shù)量增加，這與Liu等[35]提出的較多好氧細(xì)菌會(huì)引起青貯飼料中乳酸發(fā)酵不足，從而導(dǎo)致柱花草青貯飼料好氧變質(zhì)的結(jié)果一致。沙雷氏菌屬（Serratia）是腸桿菌目的一個(gè)屬，存在于土壤、水、植物以及動(dòng)物的青貯飼料中。Parvin等[36]利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)青貯原料中不存在沙雷氏菌，而青貯飼料中卻檢測到了沙雷氏菌。居泉沙雷氏菌就是青貯飼料中比較常見的1種腸道細(xì)菌，雖然是非致病性細(xì)菌，但屬于有害菌，因?yàn)樵谇噘A發(fā)酵初期，這類細(xì)菌會(huì)與乳酸菌爭奪青貯飼料中的碳水化合物，從而降低青貯飼料品質(zhì)。因此，有氧暴露改變了大麥青貯飼料菌群的菌屬結(jié)構(gòu)，抑制了乳酸菌的生長，為好氧菌的繁殖提供了良好環(huán)境，從而增加了不動(dòng)桿菌屬和沙雷氏菌屬等有害菌的相對豐度。

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