枸骨IcFPS1基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析

馬良瓊 曾慧 羅彩霞 張威威 許鋒 程水源

摘要：法尼基焦磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，F(xiàn)PS）是三萜皂苷生物合途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，為研究FPS基因在枸骨中的功能，該研究采用PCR技術(shù)將一個(gè)FPS基因的cDNA序列從枸骨葉中分離出來(lái)，并命名為IcFPS1。結(jié)果表明：根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增獲得的IcFPS1基因cDNA長(zhǎng)度為1591bp，包含一個(gè)完整的開放閱讀框，大小為1029bp。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)枸骨IcFPS1基因編碼342個(gè)氨基酸，分子量和等電點(diǎn)分別為39.58kDa和5.18。通過(guò)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白不含信號(hào)肽，不含有跨膜區(qū)域，該IcFPS1蛋白為親水性蛋白質(zhì)。通過(guò)序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白質(zhì)與其他植物的FPS蛋白質(zhì)高度同源，有共同的保守區(qū)域和氨基酸序列，其中與西洋參FPS序列的相似性高達(dá)89%。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)枸骨FPS蛋白與同屬于被子植物的五加科植物FPS蛋白親緣關(guān)系較近，說(shuō)明FPS基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)比較保守。根據(jù)蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1相互作用，參與類異戊二烯的合成代謝過(guò)程。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)IcFPS1基因在枸骨各個(gè)組織部位中均有表達(dá)，其中在枸骨根中表達(dá)量最高，在莖和雌花中表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞：枸骨，法尼基焦磷酸合酶，三萜皂苷，克隆，表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）03-0328-08

枸骨（Ilexcornuta）為冬青科灌木或喬木，四季常青，可用于綠化。同時(shí)，枸骨在傳統(tǒng)上也是常用中藥之一，枸骨根、葉、果實(shí)等組織均可入藥，在常見(jiàn)病痛治療方面有較好療效（彭國(guó)全等，2011）。根據(jù)《本草拾遺》記載，枸骨葉具備清熱養(yǎng)陰、補(bǔ)肝益腎、祛風(fēng)濕等功效，在肺癆咳嗽、勞傷失血等疾病治療方面也有很好的應(yīng)用（左文健等，2011）。枸骨葉中含有許多次生代謝物質(zhì)，包括三萜及其皂苷、黃酮及其多酚類化合物（李國(guó)文等，2011）。因此枸骨具有重要的商業(yè)和藥用價(jià)值。

枸骨葉中主要成分之一的三萜皂苷是廣泛分布于人參、靈芝、三七、墨旱蓮等藥用植物中的一類重要次生代謝產(chǎn)物，屬于中藥植物的主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化、消炎解毒等功效（張召寶等，2015）。整個(gè)三萜生物合成過(guò)程涉及法尼基焦磷酸合酶、鯊烯合酶、鯊烯環(huán)氧酶或單加氧化酶、氧化鯊烯環(huán)化酶等一系列酶的催化。法尼基焦磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，F(xiàn)PS）是一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，它催化五碳原子的二甲丙烯基焦磷酸和異戊烯基焦磷酸以頭尾連續(xù)縮合反應(yīng)，進(jìn)而形成碳原子的法尼基焦磷酸，成為植物體內(nèi)皂苷、倍半萜、甾體、橡膠等許多萜類衍生物質(zhì)的合成前體（Cunilleraetal.，1996）。至今，在洋甘菊（楊秀梅，2013）、擬南芥（Cunilleraetal.，1996）、刺五加（周秘等，2013）、絞股藍(lán)（蔣東等，2014）、三七（陳莉等，2006）等許多植物中已經(jīng)進(jìn)行了FPS基因的分離和功能研究，研究結(jié)果證實(shí)FPS是植物三萜皂苷生物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，能夠調(diào)控植物類異戊二烯途徑，促進(jìn)三萜皂苷的合成。截至目前，在枸骨上尚且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)FPS基因的研究報(bào)道，克隆FPS基因并進(jìn)行功能研究是揭示FPS基因在枸骨三萜生物合成途徑中功能的前提。在本項(xiàng)目中，我們對(duì)枸骨FPS基因進(jìn)行了克隆、對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、并進(jìn)行了組織表達(dá)分析。研究結(jié)果可為弄清FPS基因在枸骨三萜類生物合成中的調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本研究中的枸骨材料采摘于長(zhǎng)江大學(xué)校園，收集五種不同的組織（根、莖、葉、雄花、雌花）用于RNA提取和基因表達(dá)分析，采摘的材料立即在液態(tài)氮中速凍并儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱中待用。

1.2方法

1.2.1RNA的提取和cDNA合成將枸骨的不同器官（根、莖、葉、雄花、雌花）在液氮中磨成細(xì)粉末狀，參照PlantRNAExtractionKit（TaKaRa，MiniBEST）試劑盒說(shuō)明書提取各組織總的RNA。分光光度計(jì)和瓊脂凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量較好的RNA用于cDNA的合成。枸骨cDNA的合成以RNA為模板，采用PrimeScriptTM的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）完成。

1.2.2枸骨IcFPS1基因的克隆根據(jù)枸骨的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)并合成FPS基因擴(kuò)增特異引物，上游引物為IcFPSF1：5′-ATTAAGACCATCTGTGGAGCCTAGC-3′，下游引物為IcFPSR1：5′-GGGTGACAGGTTTGTATAGCATCCA-3′。PCR反應(yīng)體系25μL，包括ddH2O16.5μL，10×Buffer2.5μL，MgCl22.0μL，dNTP0.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸90s，共32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min，4℃結(jié)束。PCR擴(kuò)增結(jié)果用1%的凝膠電泳檢測(cè)，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，純化產(chǎn)物連接到從寶生物購(gòu)買的pMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)活化蘇醒后被均勻地涂抹于含有Amp的LB的培養(yǎng)皿中，挑取菌落進(jìn)菌液活化，并進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，陽(yáng)性結(jié)果菌液送往上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3生物信息學(xué)分析IcFPS基因cDNA序列和蛋白質(zhì)序列比對(duì)利用在線工具NCBI-blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BlAST/）完成。運(yùn)用VectorNTISuitev11.5和DNAMAN8來(lái)分析IcFPS1基因的cDNA序列，進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。IcFPS1蛋白質(zhì)理化學(xué)性質(zhì)的分析采用工具ProtParamtool（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行。信號(hào)肽預(yù)測(cè)、疏水性分析、跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)分別用在線工具SignalP4.1Server、ProtScale和TMHMMServerv.2.0完成。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析借助SOPMA工具實(shí)現(xiàn)。利用軟件AlignX（VectorNTISuiteV11.5）對(duì)多種植物的FPS蛋白進(jìn)行多重比對(duì)分析，利用ClustalX2.0和MEGA6.0軟件采用鄰接（NJ）方法構(gòu)建FPS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹可信性進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1000次。應(yīng)用STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）構(gòu)建候選蛋白與相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析預(yù)測(cè)IcFPS1蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)中的作用關(guān)系，保留可信度大于0.700相互作用關(guān)系，用Cytoscape3.61調(diào)整展示互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析使用RNA提取試劑盒（PlantRNAExtractionKit）從五種不同的組織器官樣品中提取總RNA。根據(jù)IcFPS1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，上游引物為IcFPSRT-S：5′-ACAGATTACCGAAGGTTGGTATG-3′，下游引物為IcFPSRT-A：5′-GGTTGTCTGGAATTCTACCTCATTA-3′。qRT-PCR內(nèi)參基因選用的是IcGAPDH，上游引物序列IcGAPDH-S：5′-TATCAACGGCTTCGGTCGCA-3′，下游引物序列IcGAPDH-A：5′-GGACGGAGTCGTACTTGAGCAT-3′。引物送往上海生工生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在杭州博日科技有限公司的Linegene9600PCR儀上進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR的操作依照試劑盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser和SYBRRPremixExTaqTMII的操作步驟說(shuō)明書逐步進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?5℃、30s，95℃、5s;60℃、30s，共40個(gè)循環(huán)。每種樣品三次取樣重復(fù)，三次技術(shù)重復(fù)，并分別設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照（模板為ddH2O）。IcFPS1基因的相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算通過(guò)使用2-ΔΔCt法完成（Livak&Schmittgen，2001）。

2結(jié)果與分析

2.1IcFPS1基因cDNA克隆與序列分析

利用特異性引物，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)從枸骨中克隆得到一條FPS基因序列，通過(guò)NCBI網(wǎng)站的在線程序Blast比對(duì)分析顯示該cDNA序列與其他物種的FPS基因序列具有較高的相一致性，克隆獲得的cDNA序列為枸骨的FPS基因，命名為IcFPS1。此cDNA序列長(zhǎng)度為1591bp，包含1029bp的開放閱讀框，編碼342個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

IcFPS1蛋白質(zhì)含有342個(gè)氨基酸。在線網(wǎng)站分析表明，IcFPS1蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)分別為39.58kDa和5.18。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為33.87，該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白。SignalP4.1Server信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IcFPS1蛋白不含有信號(hào)肽，蛋白質(zhì)疏水性分析顯示IcFPS1為親水蛋白。蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域分析結(jié)果表明，IcFPS1蛋白不含有跨膜區(qū)域。通過(guò)SOPMA工具分析該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果表明IcFPS1蛋白主要由α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)組成，其所占比例分別為65.5%、24.56%、6.73%和3.22%。同源比對(duì)分析通過(guò)在線工具BlASTP（NCBI）和AlignX（VetctorNTI11.5）完成。用NCBI的ConservedDomainSearch工具分析蛋白質(zhì)保守域，結(jié)果顯示IcFPS1蛋白質(zhì)屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超級(jí)家族的成員，含有Polyprenylsynthetase保守區(qū)域（圖2下劃線區(qū)域），表明IcFPS1參與類異戊二烯的生物合成。

2.3枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)的同源比對(duì)

同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)與其他植物的FPS蛋白質(zhì)相似性較高（圖2）。其中枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)和西洋參（ADJ68004）、人參（AAY87903）、常春藤（APV45530）、龍牙楤木（ADK12004）、積雪草（AAV58896）、白樺（AKQ62666）、野茶樹（ANA11766）、刺五加（AEY77151）和纈草（AIU63880）的FPS蛋白質(zhì)之間的相似性比分別為89%、88%、87%、87%、87%、87%、87%、87%和86%。不同物種之間FPS蛋白有較高的一致性，暗示在功能上可能也是相同或相似的。

2.4IcFPS1蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹采用ClustaIX2.0和MEGA6.0軟件構(gòu)建的，目的是進(jìn)一步探索FPS蛋白質(zhì)在不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系。如圖3所示，所有的FPS蛋白都來(lái)自于一個(gè)共同的祖先，不同物種的FPS蛋白質(zhì)也被清晰地歸類到三個(gè)分支，分別為植物、動(dòng)物和真菌（圖3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示枸骨FPS1蛋白與被子植物界雙子葉植物五加科的FPS蛋白親緣關(guān)系最近，聚類在同一分支上;而薔薇科的玫瑰、梅、白梨的FPS蛋白聚類到另一分支上。該結(jié)果表明，F(xiàn)PS1蛋白可能與五加科的FPS蛋白質(zhì)在功能上更為接近。枸骨IcFPS1在功能上也可能與五加科植物的FPS蛋白相同，參與調(diào)控三萜皂苷的合成代謝。

2.5枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)枸骨IcFPS1蛋白進(jìn)行相互作用分析，物種參數(shù)選擇模式植物擬南芥，構(gòu)建了的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖4）。IcFPS1蛋白可以與10個(gè)蛋白互作，其中IPP1、IPP2、GGPS3、GGPS6和ERA1都是植物類異戊二烯合成途徑的調(diào)節(jié)酶，該互作網(wǎng)絡(luò)表明枸骨IcFPS1蛋白可能與這些蛋白存在一些相似的功能，或共同參與植物類異戊二烯的合成代謝過(guò)程。

2.6IcFPS1的組織表達(dá)分析

為了研究IcFPS1基因的各個(gè)組織器官的表達(dá)水平，提取枸骨的根、莖、葉、雄花、雌花的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定枸骨各組織器官中IcFPS1基因的表達(dá)水平。qRT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IcFPS1基因在各個(gè)組織器官中都有表達(dá)。其中在枸骨根中的基因表達(dá)量最高，葉中表達(dá)量次之，雄花中較低，在莖和雌花中的表達(dá)量最低（圖5）。枸骨的主要藥用部位是根和葉片，本研究中IcFPS基因也在這兩個(gè)部位中表達(dá)量較高。因此，推測(cè)IcFPS基因可能參與了枸骨三萜類物質(zhì)的生物合成調(diào)控，是枸骨三萜皂苷合成代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶基因。

3討論與結(jié)論

FPS參與類異戊二烯生物合成途徑，屬于植物次生代謝三萜皂苷與甾醇合成途徑中的一個(gè)限速酶，也是三萜皂苷合成生物學(xué)研究的其中一個(gè)重要酶。本研究克隆得到枸骨的IcFPS1基因，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，IcFPS1蛋白質(zhì)屬于Isoprenoid_Biosyn_C1超級(jí)家族，與其他植物尤其是藥用植物的FPS蛋白質(zhì)具有較高的相似性，與五加科的FPS蛋白親緣關(guān)系較近，結(jié)合蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，證實(shí)枸骨IcFPS1參與類異戊二烯代謝途徑，可能參與調(diào)控枸骨三萜皂苷的生物合成。

qRT-PCR分析結(jié)果表明IcFPS1基因在枸骨各個(gè)器官組織中的表達(dá)量具有部位差異性，其中在根中的基因表達(dá)量最高，其次是葉，在莖和雌花中表達(dá)量最少，這種現(xiàn)象或許與FPS在三萜皂苷代謝途徑中的功能有關(guān)。目前已在許多植物上進(jìn)行了FPS基因的分離和功能驗(yàn)證。Cunilleraetal.（1996）克隆了擬南芥FPS基因，qRT-PCR分析結(jié)果表明擬南芥FPS1和FPS2基因在幼苗的根、莖、葉和花中都有表達(dá);其中，F(xiàn)PS1基因在根和花中最高表達(dá)，F(xiàn)PS2基因表達(dá)水平較低，具有組織表達(dá)差異性，這與我們的研究結(jié)果相似。在白木香FPS基因功能研究中，組織表達(dá)結(jié)果表明FPS基因的表達(dá)量最高是根，其次是莖，表達(dá)量最少的是葉，推測(cè)該基因在根和莖兩個(gè)組織中發(fā)揮生物學(xué)功能，與白木香的形成部位相關(guān)（楊欣等，2013）;在人參中，F(xiàn)PS基因表達(dá)分析結(jié)果表明該基因在葉的表達(dá)量最多（楊林林等，2017），這與本文研究中根的表達(dá)量最多不同。在三七FPS基因的功能研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在三七細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FPS基因可以促進(jìn)三七總皂苷積累（楊延等，2015）。周秘等（2013）對(duì)刺五加法尼基焦硫酸合酶研究發(fā)現(xiàn)，PFS基因刺五加整個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量與其皂苷含量呈現(xiàn)基本相似的變化趨勢(shì)，證實(shí)FPS是刺五加三萜皂苷生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。這些結(jié)果表明FPS基因的表達(dá)與三萜化合物的生物合成密切相關(guān)。因此可以推斷，枸骨的IcFPS1基因也可能參與了枸骨三萜類物質(zhì)的生物合成。

總之，本研究克隆獲得了枸骨的IcFPS1基因，對(duì)其核酸序列和蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，構(gòu)建了枸骨IcFPS1蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò);并分析了IcFPS1基因在枸骨不同組織部位中的表達(dá)水平，該研究為進(jìn)一步弄清IcFPS1基因在枸骨三萜皂苷生物合成中的作用奠定了基礎(chǔ)，為提高枸骨三萜皂苷含量提供了一定的理論依據(jù)。

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