汪繼濤 劉天龍 李玉文

摘 要 目的：研究Z-沒藥甾酮（Z-GL）聯(lián)合11-羰基-β-乙酰乳香酸（AKBA）對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的改善作用。方法：將雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和Z-GL+AKBA低、高劑量組（二者低、高劑量均分別為25、50 mg/kg），每組10只。除假手術組外，其余各組均采用線栓法復制大腦中動脈閉塞/再灌注損傷模型。各給藥組大鼠均于再灌注后灌胃相應藥物，假手術組和模型組大鼠灌胃等容二甲基亞砜，每12 h給藥1次，連續(xù)7 d。采用改良Longa評分法評價各組大鼠的神經(jīng)功能缺損情況，采用蘇木精-伊紅染色法觀察各組大鼠腦組織的病理學變化，采用TTC法檢測其腦梗死面積并計算腦梗死百分比，采用TUNEL法檢測其腦組織中在體細胞凋亡情況，采用免疫熒光染色法、免疫印跡法分別檢測其腦組織中CD34、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、Delta樣配體4（DLL4）的表達情況。結果：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織皮層細胞數(shù)量減少且排列不規(guī)則，可見明顯梗死區(qū)，并伴有新生血管明顯減少;其神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比均顯著升高，TUNEL陽性細胞數(shù)顯著增多，CD34、VEGF、DLL4的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述癥狀均有明顯改善，其神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比均顯著降低，TUNEL陽性細胞數(shù)顯著減少，CD34、VEGF、DLL4的表達水平均顯著升高，且Z-GL+AKBA高劑量組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積百分比、TUNEL陽性細胞數(shù)均顯著低于或少于低劑量組，CD34、DLL4的表達水平均顯著高于低劑量組（P<0.05或P<0.01）。結論：Z-GL和AKBA聯(lián)用可減輕腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)功能缺損，改善其腦損傷;這種作用可能與促進血管新生以及上調(diào)VEGF、DLL4蛋白的表達有關，并具有一定的劑量依賴性。

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of Z-guggulsterone （Z-GL） combined with acetyl-11-keto-β- boswellic acid （AKBA） on cerebral ischemia-reperfusion injury model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， Z-GL+AKBA low-dose and high-dose groups （25， 50 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except for sham operation group， middle cerebral artery occlusion/reperfusion injury model was induced by suture method in other groups. Administration groups were given relevant medicine intragastrically after reperfusion; sham operation group and model groups were given constant volume of DMSO intragastrically， every 12 h， for consecutive 7 d. The neurological deficits were evaluated with modified Longa score; HE staining was performed to observe the pathological changes of cerebral tissue in rats; the area of cerebral infarction was measured by TTC， and the percentage of cerebral infarction area; TUNEL staining was performed to detect apoptotic neurons. The expression of CD34， VEGF and DLL4 were detected by immunofluoresence and immunoblotting assay， respectively. RESULTS： Compared with sham operation group， the number of cortical cells in the model group decreased and arranged irregularly， with obvious infarct area and obvious decrease of neovascularization; the neurological deficit score， the percentage of cerebral infarction area and TUNEL positive cells increased significantly， while the expression of CD34， VEGF and DLL4 decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the above symptoms of the rats in each administration group were significantly improved， the neurological deficit score， the percentage of cerebral infarction area and the number of TUNEL positive cells were significantly reduced; the expression levels of CD34， VEGF and DLL4 were significantly increased; the neurological deficit score， the percentage of cerebral infarction area and the number of TUNEL positive cells in Z-GL+AKBA high-dose group were significantly lower or less than low dose group; the expression of CD34 and DLL4 in high-dose group was significantly higher than low-dose group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Z-GL combined with AKBA can relieve neurological deficit and cerebral injury of cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， which may be related to promoting angiogenesis and up-regulating the expression of VEGF and DLL4 protein， with a certain dose-dependent effect.

KEYWORDS? ?Cerebral ischemia-reperfusion injury; Z-guggulsterone; Acetyl-11-keto-β-boswellic acid; Angiogenesis; VEGF; Neurological deficit; Rats

缺血性腦卒中是嚴重危害人類健康的難治性疾病，發(fā)病率、致殘率和致死率均較高。腦卒中急性期西醫(yī)溶栓治療局限性大、風險性高，大多數(shù)患者因超過治療時間窗或其他禁忌證（如嚴重肝腎功能不全、近3個月有手術病史）而無法獲得滿意的治療結局，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量[1]。中醫(yī)藥治療腦卒中是中醫(yī)學歷代積累的寶貴財富。由于目前可用以改善患者腦循環(huán)的化學藥有限，而中醫(yī)諸多活血化瘀藥均具有改善腦循環(huán)的作用，且中醫(yī)治療恢復期腦卒中患者具有一定的優(yōu)勢，可調(diào)節(jié)患者整體機能、促進其神經(jīng)功能恢復，故中西醫(yī)結合治療已成為腦卒中治療的有效途徑之一[2]。有研究指出，促進缺血區(qū)結構及功能重建以及血管新生和神經(jīng)再生對慢性恢復期患者的預后至關重要，其中血管新生是其他腦細胞再生的“基石”，但如何有效促進血管新生已成為腦缺血損傷治療中亟待解決的重大醫(yī)學難題之一[1]。張錫純在《醫(yī)學衷中參西錄》中有云，“乳香、沒藥，為宣通臟腑、流通經(jīng)絡之要藥”;又曰“二藥合用，氣血并治，共奏宣通經(jīng)絡、活血祛瘀、消腫止痛、斂瘡生肌之功”[3]。本課題前期已證實，在短暫性大腦中動脈缺血模型大鼠中，沒藥的主要成分Z-沒藥甾酮（Z-GL）和乳香有效成分11-羰基-β-乙酰乳香酸（AKBA）均具有顯著的抗腦缺血再灌注（CI/R）損傷作用，且Z-GL可有效改善急性血瘀證模型大鼠的凝血和血管內(nèi)皮功能[4-6]。

目前，Notch信號通路因在血管生成中的重要作用及其與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的緊密關聯(lián)逐漸成為CI/R相關研究的熱點。其中，VEGF信號活化可促進Notch4通路的激活和Delta樣配體4（DLL4）的表達，而DLL4/Notch4信號的傳遞則有利于調(diào)控新生血管中特定類型細胞的密度和位置，最終確保正常血管的形成[7]。本課題組雖已證實了Z-GL和AKBA的腦保護作用，但考慮到?jīng)]藥、乳香為傳統(tǒng)中藥藥對，二藥常相兼而用，且其主要成分聯(lián)用對腦缺血損傷后血管新生的影響如何尚未見相關報道。為此，本研究擬將沒藥和乳香的主要成分Z-GL、AKBA作為一個整體，研究二者聯(lián)用對CI/R后血管新生的影響，并探討可能的作用機制，旨在為抗腦卒中藥物的深入研究和開發(fā)提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器

BX50/BX-FLA/DP70型光學/熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;RM2235型石蠟組織切片機（德國Leica公司）;552BR型垂直電泳槽、041BR74879型電泳儀電源、GelDoc XR型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;5810R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;D7100型數(shù)碼相機（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

Z-GL對照品（上海甄準生物科技有限公司，批號：12100905，純度：>98%）;AKBA對照品（美國Sigma公司，批號：21030320，純度：>95%）;TUNEL法檢測試劑盒（批號：C1089）、辣根過氧化物（HRP）標記山羊抗兔IgG二抗（批號：A0208）、山羊血清（批號：C0265）均購自碧云天生物科技研究所;兔抗小鼠CD34抗體（批號：10CM130）、兔抗小鼠VEGF抗體（批號：10CM199）均購自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗小鼠DLL4抗體（美國Santa Cruz公司，批號：E1407）;兔抗小鼠β-actin抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號AE071755）;Alexa Fluor? 594標記驢抗兔IgG二抗（批號：A21207）、封片液（批號：P36980）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;不含脫氧核糖核酸酶（DNase）的蛋白酶K試劑（批號：39450）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色試劑（批號：T8170）均購自北京索萊寶科技有限公司;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑（上海滬峰化工有限公司，批號：G1120）;ECL檢測試劑盒（美國Merck Millipore公司，批號：S0100）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～280 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心[動物使用合格證號：SYXK（陜）2014-001]。

2 方法

2.1 分組、給藥與造模

將大鼠隨機分為4組，即假手術組、模型組、Z-GL+AKBA低、高劑量組[二者劑量分別均為25、50 mg/kg，以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑。劑量設置參考已有文獻[4-6，8-9]：50 mg/kg Z-GL可有效發(fā)揮抗異丙腎上腺素致心肌損傷的作用，故以其作為高劑量;將25 mg/kg作為低劑量。此外，沒藥、乳香為傳統(tǒng)中藥藥對，兩者配伍比例為1 ∶ 1，且根據(jù)前期急性毒性試驗結果判定此劑量均無毒]，每組10只。采用線栓法于室溫環(huán)境下復制大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）損傷模型：所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）進行麻醉后，以仰臥位固定，鈍性分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈，并于頸總動脈分叉處開小口，將尼龍線沿頸總動脈插入頸內(nèi)動脈直至有輕微阻力為止（深度約18 mm），造成大腦中動脈閉塞;缺血2 h后，輕輕拔出尼龍線，恢復血流循環(huán)實現(xiàn)再灌注。假手術組大鼠除不插入線栓外，其余手術過程相同。造模后，假手術組和模型組大鼠均灌胃等容DMSO，各給藥組灌胃相應藥物，每12 h給藥1次，連續(xù)7 d。

2.2 神經(jīng)功能缺損評分

末次給藥后，根據(jù)改良Longa評分法評價各組大鼠的神經(jīng)功能缺損情況。評分標準——0分：四肢活動正常，無神經(jīng)功能缺損;1分：尾部垂直提起大鼠時可見左前爪呈屈曲狀態(tài)，不能伸直;2分：平地行走時大鼠向左側傾斜，身體可向左側旋轉轉圈;3分：行走不穩(wěn)，整個身體向左側傾倒;4分：有意識障礙或不能自主行走[10]。根據(jù)首次神經(jīng)功能缺損評分結果，將評分0分或4分、死亡、呼吸困難、生命體征不平穩(wěn)或處死后發(fā)現(xiàn)有顱內(nèi)出血的造模動物棄之不用，最終每組取6只大鼠進行后續(xù)研究。

2.3 組織病理學觀察

采用HE染色法。所有大鼠麻醉后處死，取腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋成蠟塊，行冠狀切片（厚度約5 μm）。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、不同濃度乙醇脫水后，依次用蘇木精、伊紅試劑染色，置于顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織的病理學變化。

2.4 腦梗死面積檢測

采用TTC法。取大鼠腦組織，由心尖至心基底部將心室切成厚約2 mm的心肌切片，置于3%TTC試劑中，于37 ℃避光染色30 min，再于4 ℃預冷的4%多聚甲醛溶液中固定2 h。使用數(shù)碼相機拍照后以Image-Pro Plus 6.0軟件處理，并計算腦梗死面積百分比（腦梗死區(qū)為白色，正常腦組織為紅色），腦梗死面積百分比=（總對側半球面積-同側半球總染色面積）/對側半球總面積×100%。

2.5 在體細胞凋亡情況檢測

采用TUNEL法。取大鼠腦組織，按“2.2”項下方法石蠟包埋后，切片（厚度約5 μm），經(jīng)脫蠟、脫水后，加入20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K試劑，于20～37 ℃下反應15～30 min;用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，加入TUNEL檢測試劑50 μL，于37 ℃避光孵育1 h;用PBS清洗3次，以封片液封片后置于顯微鏡下觀察，記錄視野中TUNEL染色陽性細胞（即染成棕色的凋亡細胞）的數(shù)量。

2.6 腦組織中CD34表達情況檢測

采用免疫熒光染色法。取大鼠腦組織，按“2.2”項下方法石蠟包埋后，切片（厚度約5 μm），并于65 ℃烤片2 h后，常規(guī)脫蠟;檸檬酸鹽修復20 min，置于3%過氧化氫溶液中浸泡10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶;用PBS清洗5 min×3次;滴加山羊血清封閉15 min，棄去上清;加入CD34抗體（稀釋度為1 ∶ 200），4 ℃孵育過夜;PBST溶液清洗5 min×3次;加入Alexa Fluor? 594標記驢抗兔IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 500），37 ℃孵育1 h;PBST溶液清洗5 min×3次，中性樹膠封片后置于熒光顯微鏡下觀察，使用Image Pro Plus 6.0軟件處理，以CD34陽性表達細胞（即染色后呈紅色的細胞）的熒光強度表示CD34的表達水平。上述試驗重復3次。

2.7 腦組織中DLL4、VEGF蛋白表達情況檢測

采用免疫印跡法。取大鼠腦組織，采用研磨法提取蛋白適量，于95 ℃變性后，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結束后轉移至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶封閉30 min。加入相應一抗（DLL4、VEGF、β-actin的稀釋度分別為1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000），4 ℃孵育過夜;用TBST溶液清洗3次，加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 2 000），37 ℃孵育1 h;TBST溶液清洗3次，以ECL檢測試劑盒顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像并使用Quantity One v.2.0軟件處理，以相應蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示該蛋白的表達水平。上述試驗重復3次。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA）或Bonferroni檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 Z-GL+AKBA對MCAO/R損傷模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響

與假手術組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低，且高劑量組顯著低于低劑量組（P<0.01），詳見表1。

3.2 Z-GL+AKBA對MCAO/R損傷模型大鼠腦組織病理學的影響

假手術大鼠皮層細胞排列有序，且細胞結構清晰、致密，核仁清晰可見;模型組大鼠大腦皮層缺血灶周圍細胞數(shù)量明顯減少，且排列不規(guī)則，大多數(shù)核皺縮;各給藥組大鼠上述癥狀均較模型組有所好轉，詳見圖1。

3.3 Z-GL+AKBA對MCAO/R損傷模型大鼠腦梗死區(qū)的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織可見明顯的灰白色梗死區(qū)，其腦梗死面積百分比顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠的腦梗死區(qū)均有所縮小，腦梗死面積百分比均顯著降低，且高劑量組顯著低于低劑量組（P<0.01），詳見圖2、表1。

3.4 Z-GL+AKBA對MCAO/R損傷模型大鼠TUNEL陽性細胞數(shù)的影響

假手術組大鼠腦組織中未見或可見少量TUNEL陽性細胞;模型組大鼠腦組織中可見大量TUNEL陽性細胞，其數(shù)量較假手術組顯著增加（P<0.01）;各給藥組大鼠腦組織中TUNEL陽性細胞明顯減少，其數(shù)量均較模型組顯著減少，且高劑量組顯著少于低劑量組（P<0.05或P<0.01），詳見圖3（圖中，箭頭表示TUNEL陽性細胞）、表1。

3.5 Z-GL+AKBA對MCAO/R損傷模型大鼠腦血管新生的影響

假手術組大鼠腦組織中血管豐富，形態(tài)清晰;模型組大鼠腦組織中新生血管明顯減少，CD34的表達水平較假手術組顯著降低（P<0.01）;各給藥組大鼠腦組織中新生血管明顯增多，CD34的表達水平均較模型組顯著升高，且高劑量組顯著高于低劑量組（P<0.05或P<0.01），詳見圖4、表2。

3.6 Z-GL+AKBA對MCAO/R損傷模型大鼠腦組織中VEGF、DLL4表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中VEGF、DLL4的表達水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中VEGF、DLL4的表達水平均顯著升高，且高劑量組DLL4的表達水平顯著高于低劑量組（P<0.05或P<0.01），詳見圖5、表2。

4 討論

乳香、沒藥作為經(jīng)典的活血化瘀藥對，多見于名家典籍[11]?！侗静菥V目》言，“乳香活血、沒藥散血，皆能止痛、消腫、生肌”;《海藥本草》記載，二者“主折傷馬墜，推陳出新，能生好血，研爛，以熱酒調(diào)服”;《本草述》曰，“久服舒筋膜，通血脈，固齒牙，長須發(fā)”，故二藥每每相兼而用。同時，沒藥、乳香也作為藥對常見于中成藥或方劑（如活絡效靈丹、腦心通膠囊）中。沒藥、乳香的有效成分Z-GL、AKBA均具有明顯的抗CI/R損傷作用，但尚未見兩種成分聯(lián)用效果評價的相關文獻。為此，本文在前期研究的基礎上，對兩藥有效成分對MCAO/R損傷模型大鼠的改善作用及其對大鼠新生血管的影響進行了初步探討。

血管新生屬于中醫(yī)學“生脈”范疇。益氣活血生脈也包含有“祛瘀生新”的含義，瘀血去，則新血及新脈生，生新脈又反過來促進瘀血祛除[12]。許多中藥單體、單味藥及中藥復方都具有很好的促進血管新生的作用：余小平等[13]發(fā)現(xiàn)，復方丹參片可通過增加急性腦缺血模型大鼠腦內(nèi)VEGF和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的表達，從而促進缺血組織側支循環(huán)的建立、改善神經(jīng)功能;田兆華等[14]發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯可調(diào)節(jié)局灶性腦缺血模型大鼠腦缺血區(qū)VEGF等的表達，增強血管內(nèi)皮細胞的趨化作用，并促進其增殖、移行和分化以確保新生血管網(wǎng)絡的建立。本研究采用MCAO/R損傷大鼠模型，考察了Z-GL+AKBA的腦保護作用。結果顯示，假手術組大鼠未見神經(jīng)功能異常，皮層細胞排列有序，無明顯腦梗死區(qū)，未見或可見少量TUNEL陽性細胞。造模后，模型組大鼠大腦皮層缺血灶周圍細胞數(shù)量明顯減少，且排列不規(guī)則，可見明顯的腦梗死區(qū)和大量的TUNEL陽性細胞，其神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積百分比、TUNEL陽性細胞數(shù)均顯著升高。經(jīng)Z-GL+AKBA處理后，各給藥組大鼠上述癥狀均有所好轉，其神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積百分比、TUNEL陽性細胞數(shù)均顯著降低，且Z-GL+AKBA高劑量組上述指標均顯著低于低劑量組。這提示二者聯(lián)用可減輕模型大鼠的神經(jīng)功能損傷，減少在體細胞凋亡，縮小其腦梗死面積，并具有一定的劑量依賴性。

腦缺血后血管新生是由多種細胞因子和信號通路共同參與的動態(tài)的、復雜的生理過程。其中，Notch信號網(wǎng)絡在調(diào)節(jié)血管出芽和分支形成，調(diào)控動靜脈形成、內(nèi)皮祖細胞分化和血管平滑肌細胞的成熟穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著重要的作用[7]。在血管新生的調(diào)節(jié)通路中，配體Jagged1和DLL4通過與Notch4競爭性結合，共同調(diào)控血管新生相關信號的轉導[15]。Gridley T等[16]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞DLL4表達上調(diào)，可激活鄰近細胞Notch4受體，啟動細胞內(nèi)信號轉導，誘導靶基因Hes3、Shh表達，促使血管形成。更深入的研究表明，減少VEGF的表達可使DLL4的表達受到抑制，最終導致內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管網(wǎng)絡形成受阻。這提示VEGF-DLL4信號通路對調(diào)節(jié)Notch級聯(lián)信號轉導通路、保證正常血管生成具有重要意義[17]。本研究結果顯示，模型組大鼠腦組織中的新生血管明顯減少，CD34、VEGF、DLL4的表達水平均顯著降低。經(jīng)Z-GL+AKBA處理后，大鼠腦組織中的新生血管有所增多，CD34、VEGF、DLL4的表達水平均顯著升高，且Z-GL+AKBA高劑量組CD34、DLL4的表述水平均顯著高于低劑量組。這提示二者聯(lián)用可促進血管內(nèi)皮標志物（CD34）的表達，促進血管新生，并上調(diào)VEGF、DLL4的表達，且具有一定的劑量依賴性。

綜上所述，Z-GL和AKBA聯(lián)用可減輕MCAO/R損傷模型大鼠的神經(jīng)功能缺損，改善其腦損傷;這種作用可能與促進血管新生以及上調(diào)VEGF、DLL4蛋白的表達有關。本研究為沒藥-乳香藥對治療腦卒中提供了實驗基礎，但具體機制尚有待后續(xù)研究進一步完善;此外，乳香、沒藥配伍后，其有效成分（尤其是Z-GL、AKBA）是否會發(fā)生變化，也有待于后續(xù)研究深入探討。

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（收稿日期：2019-07-12 修回日期：2019-11-25）

（編輯：張元媛）