張寬朝 張 琛 阮 飛 何孔泉 楊 超

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036)

食用色素是用于改善食品質(zhì)量和外觀的重要食品添加劑[1]。近年來(lái)，在食品工業(yè)、制藥和化妝品行業(yè)中食用色素被廣泛應(yīng)用。根據(jù)來(lái)源可將食用色素分為合成色素和天然色素兩類(lèi)。然而，隨著醫(yī)學(xué)毒理學(xué)和生物學(xué)研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)合成色素中的不少品種具有慢性毒性和致癌性，因此天然色素的應(yīng)用和探索受到了更多的關(guān)注[2]。從生物體內(nèi)提取的天然色素，由于較高的安全性，另外還含有人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素或其近似的化學(xué)類(lèi)似物，具有很大的生物活性和對(duì)人體至關(guān)重要的抗氧化活性，逐漸為人們所重視，研究逐步深入[3,4]。棕色素是色素中的黃色物質(zhì)與紅色物質(zhì)混合成的一類(lèi)復(fù)合色素，常來(lái)源于植物成熟的果實(shí)、種子、果殼或果核中，可用于著色棕色食品[5]。目前，對(duì)龍眼、金櫻子、榛殼、山核桃殼、板栗殼等中的棕色素進(jìn)行了研究[6-10]。

油茶(CamelliaoleiferaAbel),山茶科山茶屬常綠小喬木，分布于中國(guó)南方的18個(gè)省市。油茶是我國(guó)特有的木本油料作物，據(jù)“山海經(jīng)”記載，油茶種子已在中國(guó)使用超過(guò)二千多年[11]。油茶的種子主要用于油脂提取，油茶籽還含有大量的生物活性多糖和蛋白質(zhì)、脂肪、鞣酸、咖啡因、皂苷等其他活性成分，因此，可以進(jìn)一步挖掘油茶籽的綜合開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[12]。油茶籽殼為油茶籽質(zhì)地堅(jiān)硬的外種皮，主要含有木質(zhì)素、多縮戊糖、色素和一定含量的抗氧化活性物質(zhì)[13,14]。針對(duì)油茶籽殼的利用研究主要集中在活性炭、木糖醇和糠醛等產(chǎn)品的制備上，利用率較低[15]。劉曉庚[16]分析油茶副產(chǎn)品成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，油茶果殼色素、茶餅粕色素的光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好。凌誠(chéng)德等研究表明，國(guó)產(chǎn)食用天然色素油茶果殼棕色素具有巧克力樣色澤，未發(fā)現(xiàn)明顯的急性和亞急性毒性，可以作為一種很有前途的安全天然食用色素[17]。油茶籽殼中含有的色素成分尚未能得到有效地開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，對(duì)油茶籽殼棕色素的提取等的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討油茶籽殼棕色素的提取工藝，并通過(guò)響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝條件，同時(shí)采用體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定提取棕色素的抗氧化活性，以期為油茶籽殼綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成熟油茶籽：去仁留殼，60 ℃烘干，粉碎機(jī)粉碎，得油茶籽殼粉末備用。

無(wú)水乙醇，甲醇，丙酮，乙酸乙酯，過(guò)氧化氫，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵等均為分析純。

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器， DHG-9425A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，UV-1600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，HH-2J數(shù)顯恒溫水浴鍋， JA2003C 電子天平。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

工藝流程：油茶籽殼粉末→溶劑浸提→抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮→真空干燥→產(chǎn)品稱(chēng)重。

棕色素含量(mg/g)=棕色素產(chǎn)品質(zhì)量/油茶籽殼質(zhì)量×1000。

1.2.2 不同提取溶劑比較

稱(chēng)取5.000 0 g油茶籽殼粉末，在液料比(10 ∶1)、提取溫度(50 ℃)、提取時(shí)間(1 h)的條件下，分別用甲醇、50%乙醇、純水、丙酮和乙酸乙酯作為提取溶劑，按提取工藝對(duì)油茶籽殼進(jìn)行棕色素提取，研究不同溶劑對(duì)提取率的影響。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

溫度對(duì)提取率的影響：設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件為乙醇濃度50%、液料比10 ∶1、提取時(shí)間1 h，研究提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)油茶籽殼棕色素提取的影響。

液料比對(duì)提取率的影響：通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度，設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間1 h，研究液料比(6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1、14 ∶1)對(duì)油茶籽殼棕色素提取的影響。

乙醇濃度對(duì)提取率的影響：通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度、液料比，設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件為提取時(shí)間1 h，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)油茶籽殼棕色素提取的影響。

提取時(shí)間對(duì)提取率的影響：通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)確定最佳提取溫度、液料比、乙醇濃度，研究提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)對(duì)油茶籽殼棕色素提取的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取溫度(A)、液料比(B)、乙醇濃度(C)、提取時(shí)間(D)4個(gè)因素作為自變量，編碼水平為-1、0 和1，以油茶籽殼棕色素提取含量為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)因素編碼及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.5 抗氧化能力測(cè)定

式中：A0是鄰苯三酚自氧化速率；A1是樣品溶液加入后的鄰苯三酚氧化速率。

清除H2O2能力的測(cè)定：參考紫外分光光度法[19]。

還原能力的測(cè)定：參考鐵氰化鉀法[20]。700 nm處測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度，吸光度值越高,還原能力則越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑比較

采用甲醇、50%乙醇、純水、丙酮和乙酸乙酯作為提取溶劑，分別對(duì)油茶籽殼棕色素進(jìn)行提取。結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，50%乙醇作為提取溶劑時(shí)油茶籽殼棕色素提取率最高，丙酮溶液次之，其后依次是甲醇、純水、乙酸乙酯。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)油茶籽殼棕色素提取的影響

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

溫度、液料比、乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)油茶籽殼棕色素提取的影響如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比10 ∶1、提取時(shí)間1 h時(shí)，油茶籽殼棕色素的提取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，可能色素分子運(yùn)動(dòng)的速度加快，有利于油茶籽殼棕色素的溶解和釋放。提取溫度為40 ℃時(shí)，油茶籽殼棕色素提取率達(dá)到最大。其后，隨著溫度的升高，可能伴隨乙醇揮發(fā)加快以及色素化學(xué)結(jié)構(gòu)的破壞，棕色素提取率有所下降。由此，選用40 ℃為最佳提取溫度。

圖2 不同因素對(duì)油茶籽殼棕色素提取的影響

實(shí)驗(yàn)條件為提取溫度40 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間1 h時(shí)，當(dāng)液料比小于10 ∶1時(shí)，隨著液料比的增大，油茶籽殼棕色素提取率逐漸增大，這可能是由于液料比的增加促進(jìn)了更多的棕色素溶解在乙醇溶液中。當(dāng)液料比大于10 ∶1時(shí)，可能因?yàn)樽厣匾呀咏咳艹?，油茶籽殼棕色素提取率略有下降。由此，從油茶籽殼棕色素提取含量和原料?jié)省方面考慮，選用10 ∶1為最佳提取液料比。

實(shí)驗(yàn)條件為提取溫度40 ℃、液料比10 ∶1、提取時(shí)間1 h時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，油茶籽殼棕色素提取含量增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，棕色素的提取量開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)橐掖紳舛仍礁?，?duì)細(xì)胞的破壞程度越大，越有利于棕色素的析出，但當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致棕色素的部分降解，從而造成棕色素提取含量的下降。由此，選用60%乙醇體積分?jǐn)?shù)為最佳提取濃度。

以提取溫度40 ℃、液料比10 ∶1、乙醇濃度60%為實(shí)驗(yàn)條件，油茶籽殼棕色素提取質(zhì)量隨提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后上升的趨勢(shì)。提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，油茶籽殼棕色素提取含量最高。其后，提取時(shí)間延長(zhǎng)，棕色素發(fā)生氧化分解，導(dǎo)致提取含量開(kāi)始降低。由此，選用提取時(shí)間2.0 h為最佳提取時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面分析方案

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)響應(yīng)結(jié)果

2.3.2 方差分析及顯著性檢驗(yàn)

用Design-Expert.8.0.6軟件對(duì)表2所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型方差分析。分析結(jié)果如表3所示。對(duì)各因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程為：

油茶籽殼棕色素提取含量=-79.311 3+1.191 18A+5.446 25B+0.940 65C+14.405 67D-0.022 75AB-4.75×10-4AC-0.166AD-0.019 25BC+0.767 5BD-0.013CD-8.532 5×10-3A2-0.226 44B2-5.382 5×10-3C2-4.103D2。

各因素的F值可以直觀反映各因素影響的大小，F(xiàn)值越大，其對(duì)響應(yīng)值的影響也越大。對(duì)各因素影響程度的分析可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A=0.048，F(xiàn)B=2.085×10-3，F(xiàn)C=15.07，F(xiàn)D=51.26，各因素對(duì)油茶籽殼棕色素提取含量影響大小順序?yàn)樘崛r(shí)間>乙醇濃度>溫度>液料比。

2.3.3 因素交互作用分析

為進(jìn)一步分析溫度、液料比、乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響，固定其中任兩個(gè)因素，繪制另兩個(gè)因素之間交互作用的等高線和響應(yīng)面圖，可視化分析各因素間的交互作用。

表3 回歸模型方差分析

注:模型的確定系數(shù)R2=0.899 4,模型的調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.798 8。**差異極顯著(P<0.01)；*差異顯著 (P<0.05)。

從等高線和響應(yīng)面圖可以看出各個(gè)因素之間的相互作用，直觀反映各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線形狀和響應(yīng)面曲面坡度可以反映自變量交互效應(yīng)的強(qiáng)度。等高線形狀若趨向于橢圓形，則兩自變量之間交互作用明顯，若趨于圓形則相反；等高線密度大，表明因素間交互作用較強(qiáng)。響應(yīng)面曲面的傾斜度越高，即坡度越陡，說(shuō)明因素間交互作用越顯著，同時(shí)，隨著變化趨勢(shì)的劇烈增加，曲面顏色也呈加深趨勢(shì)。由此，分析可知，溫度與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)響應(yīng)值油茶籽殼棕色素提取含量的影響顯著(如圖3、圖4所示)，其他因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。因素交互作用的分析結(jié)果驗(yàn)證了回歸模型方差分析。

2.3.4 最優(yōu)工藝條件確定與模型驗(yàn)證

通過(guò)軟件對(duì)方程進(jìn)一步分析得出，提取的最佳條件為提取溫度33.98 ℃，液料比10.99 ∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)63.82%、提取時(shí)間1.99 h，在此條件下提取率的預(yù)測(cè)值為15.23%。由于對(duì)條件可操作性考慮，將最佳提取工藝條件修正為提取溫度35 ℃、液料比11 ∶1、乙醇濃度65%、提取時(shí)間2h，經(jīng) 3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到提取率為15.09%，與預(yù)測(cè)值相偏差為0.91%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后的提取條件參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值。

圖3 溫度及提取時(shí)間交互作用對(duì)油茶籽殼棕色素提取率的等高線和響應(yīng)面圖

圖4 液料比及提取時(shí)間交互作用對(duì)油茶籽殼棕色素提取率的等高線和響應(yīng)面圖

2.4 油茶籽殼棕色素抗氧化能力測(cè)定

圖5 油茶籽殼棕色素清除能力、清除H2O2能力及還原能力

在質(zhì)量濃度10.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)，隨著溶液質(zhì)量濃度的增加，油茶籽殼棕色素對(duì)過(guò)氧化氫的清除率也隨之增高。當(dāng)質(zhì)量濃度大于60.0 μg/mL時(shí)，油茶籽殼棕色素對(duì)過(guò)氧化氫的清除率趨向于平緩，基本維持在35%左右。

在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，油茶籽殼棕色素溶液具有良好的還原性能力，可作為良好的電子供應(yīng)者。隨著棕色素質(zhì)量濃度的最大，其還原能力也隨之增強(qiáng)。

3 結(jié)論

以油茶籽殼為原料，考察了提取溫度、液料比、乙醇濃度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)棕色素提取的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了油茶籽殼棕色素提取工藝。結(jié)果表明，影響油茶籽殼棕色素提取含量高低的因素主次順序?yàn)樘崛r(shí)間>乙醇濃度>溫度>液料比，溫度與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間的交互作用顯著。最佳提取工藝條件為提取溫度35 ℃、液料比11 ∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時(shí)間2h。在此條件下，得到油茶籽殼棕色素提取率為15.09%，與預(yù)測(cè)值基本一致。