李蒙蒙，王雨萱，唐蕾,*

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

血紅素(heme)是一種含鐵卟啉化合物，又稱為血紅素鐵，是血紅蛋白和肌紅蛋白的重要組成部分，參與生物體內的電子傳遞、細胞信號傳導等重要的生理生化反應過程。在大腸桿菌中主要以C5途徑合成血紅素，如圖1所示，其生物合成受到嚴格調控[1-2]。血紅素也是許多過氧化物酶的輔基，其生物合成量對過氧化物酶的活性具有重要作用，如提高血紅素的合成有利于抗壞血酸過氧化物酶[3]、染料脫色過氧化酶[4]活性的提高。而且血紅素鐵有易于被吸收、無副作用等優(yōu)點，因而作為食品添加劑、補鐵劑等被廣泛應用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[5]。

圖1 大腸桿菌血紅素合成途徑Fig.1 The heme synthesis pathway of E.coli

鐵離子是大多數細菌生長所必需的一種營養(yǎng)物質，胞內鐵離子過多或過少都會對細菌的生長產生不利影響，同時血紅素的生物合成也受到鐵的可用性調節(jié)[6]。鐵攝取調節(jié)子(ferric uptake regulator，Fur) 是細菌鐵離子代謝中最重要的調節(jié)子，鐵的全局轉錄調控由Fur蛋白介導。此外，Fur還參與細菌的能量代謝、抗酸能力、毒力和氧化應激等多種生物過程的調節(jié)[7]。Fur通過抑制或者激活基因的轉錄，來調節(jié)與鐵攝取、利用和儲存相關的基因，維持胞內鐵離子濃度動態(tài)平衡[8-9]，而在血紅素合成途徑的最后一步中，原卟啉Ⅸ在亞鐵鰲合酶的作用下鰲合Fe2+生成血紅素[10]，但關于fur基因對大腸桿菌(Escherichacoli)血紅素合成的影響未見進一步的研究。

本文以E.coliBL21為出發(fā)菌株，通過對鐵攝取調節(jié)子Fur蛋白基因fur的過量表達，分別探究了不同條件下fur基因對菌體生長、鐵離子濃度、血紅素合成、血紅素合成途徑關鍵酶基因表達水平的影響，為尋找提高血紅素合成策略提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

實驗所用菌株和質粒見表1。

表1 本研究中使用的菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑及儀器

限制性內切酶(EcoR I，XhoI)、T4DNA連接酶、DNA聚合酶:寶生物工程(大連)有限公司；2,2′-聯吡啶(2,2′-dipyridyl，dip):阿拉丁試劑公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside， IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素鈉(Amp):生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白胨、NaCl、酵母粉:國藥集團化學試劑有限公司。

核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；可見光分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；Enspire多標記檢測系統(tǒng)(酶標儀)，珀金埃爾默有限公司；電感耦合等離子體質譜儀，德國布魯克公司；實時熒光定量PCR儀，美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

細菌肉湯培養(yǎng)基(LB)(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，固體LB培養(yǎng)基加入20 g/L的瓊脂。

限鐵培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基的基礎上添加終濃度為200 μmol/L的Dip。

搖瓶發(fā)酵條件：250 mL搖瓶裝液量50 mL，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。在菌株構建和發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基添加的氨芐青霉素和硫酸卡那霉素終質量濃度分別為100和50 mg/L，IPTG終濃度0.2 mmol/L。

1.2 鐵攝取調節(jié)子基因過表達重組菌的構建

(1)引物設計及合成：通過NCBI下載fur基因序列，利用DNAMAN軟件設計引物，在5′端分別引入EcoRI 與XhoI限制性酶切位點及保護堿基。引物序列及限制性酶切位點見表2。

表2 過表達菌株構建所用引物Table 2 List of primers used in the construction of over expressing strains

注：″-GCG-″為保護堿基，″-GAATTC-″與″-CTCGAG-″分別為EcoRI 與XhoI限制性酶識別序列。

(2)產物擴增與連接：以E.coli基因組DNA為模板，以相應引物對fur基因的全長進行擴增。擴增產物經膠回收試劑盒回收后先加A尾后，再進行連接pMD19-T載體，將連接產物熱轉化E.coliJM109中，挑取陽性克隆培養(yǎng)，提取質粒后酶切驗證，將驗證正確的質粒進行測序，測序正確的保菌進行后續(xù)實驗。將上述驗證正確的質粒pMD19-T-fur與pET28a質粒進行酶切40 min，膠回收后進行16 ℃過夜連接。

(3)連接產物轉化與陽性克隆驗證：將連接產物熱轉化E.coliJM109中，挑取陽性克隆培養(yǎng)，提取質粒后酶切驗證，將驗證正確的質粒進行測序，將測序正確的保種。重組質粒結構如圖2所示。測序正確的質粒熱轉化到表達宿主E.coliBL21中，挑取陽性克隆進行保種，并名為Eco/pEF。

圖2 重組質粒pET28a-fur示意圖Fig.2 Scheme of recombinant plasmid pET28a-fur

1.3 重組蛋白表達及SDS-PAGE檢測

參照文獻陳丹園等[11]實驗方法檢測重組菌株蛋白表達情況。

1.4 生長曲線測定

將各菌株于37 ℃、200 r/min搖床上過夜培養(yǎng)后以1%(體積分數)的接種量轉接LB培養(yǎng)基及限鐵培養(yǎng)基中，相同條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)到2 h時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，每間隔2 h取樣測定菌液在600 nm下的吸光值，每株菌3個平行，共測定12 h的數據。

1.5 ICP-MS法測定胞內鐵含量

參考文獻[12]利用電感耦合等離子體質譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)測定胞內鐵含量。

將過夜活化的菌株按1%的轉接量轉接于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)2 h后加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，誘導5 h后收集菌體。用含有5 mmol/L EDTA的磷酸鹽PBS緩沖液清洗2遍(10 000 r/min，5 min)，再用不含有EDTA的PBS緩沖液清洗菌體2遍(10 000 r/min，5 min)，之后轉移至5 mL離心管中 105 ℃過夜烘干；分別稱取干重后加5 mL濃硝酸進行石墨消解120 ℃ 45 min，經蒸發(fā)后使用超純水定容到50 mL，之后用于ICP-MS測定，得到樣品鐵的濃度。計算方法如公式(1)、(2)：

(1)

(2)

式中：A為菌體干重，mg；B為定容體積，50 mL；C為樣品質量濃度，g/L；D為鐵質量濃度，μg/mL。

1.6 血紅素及5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)濃度測定

將各菌株于37 ℃、200 r/min搖床上過夜培養(yǎng)后以1%(體積分數)的接種量轉接LB培養(yǎng)基及限鐵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到2 h時加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，誘導培養(yǎng)5 h后取樣測定血紅素及卟啉物質的含量。根據參考文獻陳丹園等[11]、MICHENER等[13]利用熒光法測定血紅素濃度。血紅素合成的前體物質ALA的測定參照ZHANG等[14]。

1.7 實時熒光定量PCR

各菌株于37 ℃、200 r/min搖床過夜培養(yǎng)后以1%(體積分數)的接種量轉接新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 h后加入IPTG誘導，誘導到對數生長期后12 000 r/min、4 ℃、5 min收集菌體，用50 g/L的溶菌酶37 ℃破壁30 min。之后按照TaKaRa試劑盒說明書進行總RNA提取，提取的RNA濃度及純度使用核酸定量儀測定，然后RNA直接反轉錄成cDNA用于熒光定量實驗。以上述cDNA為模板，熒光定量PCR引物見表3，選擇編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因gapA作為內參基因，采用SYBR? Green I嵌合熒光法，反應體系參照試劑盒說明書。

2 結果與分析

2.1 鐵攝取調節(jié)子基因過表達重組菌的構建

2.1.1 基因fur片段的擴增與連接

提取E.coliBL21基因組，以E.coliBL21基因組為模板，以fur-P-F/fur-P-R為引物擴增目的片段。擴增片段如圖3所示。由圖3可知，片段大小與理論值相符，目的片段擴增成功。

2.1.2 擴增產物連接與轉化

擴增產物連接至pMD19-T載體，進行雙酶切驗證，如圖4-A。雙酶切驗證正確的質粒測序驗證，結果正確。將pET28a空載質粒進行相同的雙酶切，如圖4-B。由圖4可知酶切驗證正確，膠回收后16 ℃過夜進行連接。

表3 熒光定量PCR引物Table 3 Primers used in RT-qPCR

M-DNA marker；1-基因fur圖3 目的基因fur的擴增Fig.3 Amplification of the target gene fur

A-質粒pMD19-T-fur雙酶切;B-質粒pET28a雙酶切圖4 質粒的雙酶切驗證Fig.4 Double enzyme digestion verification of plasmid注：M-DNA marker；A-1：基因fur；B-1：酶切后的pET28a。

2.1.3 陽性克隆篩選與鑒定

將連接產物熱轉化到克隆宿主E.coliJM109中，在Kan抗性平板上篩選陽性克隆單菌落，提取質粒后進行雙酶切驗證，結果如圖5所示。

M-DNA marker；1-重組質粒pET28a-fur雙酶切后的凝膠電泳圖5 重組質粒pET28a-fur的雙酶切驗證Fig.5 Verification of recombinant plasmid pET28a-fur by double enzyme digestion

由圖5可知，雙酶切條帶驗證正確。之后進行測序驗證，將測序正確的單克隆保種后進行后續(xù)實驗，并將其命名為Eco/pEF。

2.1.4 重組蛋白表達及SDS-PAGE檢測

為了檢測鐵攝取調節(jié)子基因fur過表后產生的蛋白是否可溶，對Eco/pEF菌株誘導然后進行SDS-PAGE檢測，蛋白Fur分子質量約為17 kDa，其蛋白的表達檢測結果如圖6所示。

M-Marker；1-E.coli BL21全細胞；2-E.coli BL21 破碎上清；3-E.coli BL21破碎沉淀；4-Eco/pEF誘導后全細胞；5-Eco/pEF誘導破碎上清；6-Eco/pEF誘導破碎沉淀圖6 重組蛋白的檢測Fig.6 Detection of recombinant protein

由圖6可知，在誘導后的全細胞中即第4泳道、在破碎細胞的上清中即第5泳道及在誘導破碎后的沉淀中即第6泳道都檢測到Fur蛋白的條帶，第5泳道的Fur蛋白條帶說明重組菌中有可溶性表達的Fur。以泳道1的Fur條帶為參照，通過Image Lab軟件對泳道4、5、6的Fur條帶進行掃描定量，其蛋白表達量分別增加了12.23、9.47、8.49倍。因此，Fur蛋白表達量增加，重組菌株Eco/pEF可以用于后續(xù)的實驗。

2.2 鐵攝取調節(jié)子基因過表達對重組菌生長的影響

由于Fur蛋白調控鐵代謝相關基因的轉錄，而鐵元素對于細菌的生長和生理過程又至關重要。為了分析Fur的過表達是否能夠影響菌株的生長，我們測定了野生型(wild)與fur過表達菌株(Eco/pEF)在LB培養(yǎng)基和限鐵培養(yǎng)基中(LB+Dip培養(yǎng)基)中的生長曲線。結果如圖7所示。

圖7 菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線Fig.7 Growth curve of each strain under different culture conditions

由圖7可知，相比于對照組(wild)，LB培養(yǎng)條件下鐵攝取調節(jié)子基因fur的過表達抑制了Eco/pEF菌株的生長；對照LB培養(yǎng)條件下，限鐵條件下wild菌株與Eco/pEF菌株的生長均受到抑制；同時對比發(fā)現，限鐵條件下Eco/pEF菌株的生長進一步受到抑制。此結果說明，鐵攝取調節(jié)子基因fur的過表達會抑制菌株的生長；并且由缺鐵條件下菌體生長受到抑制可以進一步說明胞外鐵離子濃度對菌體生長至關重要。我們推測鐵攝取調節(jié)子基因fur的過表達引起了菌株胞內鐵離子含量的變化，進而影響了菌株的生長代謝。

2.3 鐵攝取調節(jié)子基因過表達對重組菌胞內鐵離子濃度的影響

一方面，鐵元素對于細胞來說是必需的，鐵含量減少時會影響菌體的生長；另一方面，過量的鐵又會引起Fenton反應來毒害細胞[15]。所以，細胞內鐵含量的穩(wěn)態(tài)對于細胞來說是必需的。在絕大多數革蘭氏陰性細菌中，Fur是調控鐵吸收轉運的關鍵轉錄調控因子。因此，我們通過ICP-MS方法測定了LB培養(yǎng)條件下與LB+Dip培養(yǎng)條件下wild菌株與Eco/pEF菌株中鐵離子的含量。結果如圖8所示。

圖8 不同培養(yǎng)條件下菌株胞內總鐵含量Fig.8 Total intracellular iron content of strains under different culture conditions

由圖8可知，LB培養(yǎng)條件下，鐵攝取調節(jié)子基因過表達菌株Eco/pEF的胞內鐵離子含量減少；鐵攝取調節(jié)子Fur蛋白作為細菌胞內鐵離子濃度感受器和鐵離子依賴性轉錄阻遏蛋白，在有亞鐵離子作為輔因子的條件，Fur與Fe2+形成Fur-Fe2+復合物對鐵離子轉運系統(tǒng)有轉錄抑制作用[16-17]。Fur蛋白大量存在時，與Fe2+結合形成的Fur-Fe2+復合物會抑制鐵離子轉運系統(tǒng)的表達，因而鐵離子含量減少。

由圖8可以看出，LB+Dip培養(yǎng)條件下，菌株胞內鐵離子均顯著減少。菌株胞內鐵離子的減少，會造成胞內鐵離子代謝的不平衡，從而影響菌體的生長。由于外源鐵螯合劑Dip的加入，使菌體處于相對缺鐵的環(huán)境，菌體鐵的轉運吸收會進一步受到限制，所以其菌體胞內鐵離子含量顯著減少，同時菌體的生長也受到顯著限制。

綜上結果表明，Fur蛋白的過表達對菌體生長不利，會導致胞內鐵離子量減少從而使菌體的生長受到抑制。外源環(huán)境缺鐵時，菌體胞內鐵離子的轉運受到影響，胞內鐵離子濃度進一步減少，菌體生長受到的抑制更顯著。

2.4 鐵攝取調節(jié)子基因過表達對血紅素合成的影響

在大腸桿菌中，血紅素合成途徑中的前體物質ALA是血紅素合成的限速步驟[18]；另外，原卟啉Ⅸ在亞鐵鰲合酶的作用下鰲合鐵離子形成血紅素也是其中的一個限速步驟[19]。為了分析鐵攝取調節(jié)子Fur蛋白對血紅素合成途徑的影響，以明確Fur蛋白在血紅素合成途徑中的作用，本研究按照1.6的方法對不同條件下培養(yǎng)后的wild菌株與Eco/pEF菌株進行血紅素及前體物質ALA的測定。結果如圖9所示。

a-ALA質量濃度;b-血紅素質量濃度圖9 菌株的ALA與血紅素含量Fig.9 Content of ALA and heme of strains

由圖9可知，LB培養(yǎng)條件下，過表達菌株Eco/pEF的血紅素合成量降低，胞外ALA的合成量增加，說明Fur蛋白的過量產生對血紅素的合成有抑制作用；限鐵條件下，過表達菌株Eco/pEF的血紅素合成量增加，胞外ALA的合成量減少，說明限鐵條件下Fur蛋白的過量產生卻促進了血紅素的合成，由于血紅素在細胞呼吸、電子傳遞、氧氣運輸及信號傳導等生理過程中具有重要作用[20]，推測可能在限鐵條件下，Fur蛋白的過量產生使鐵離子更多地流向血紅素合成途徑，以維持細胞一些重要的生理活動和生長。

2.5 鐵攝取調節(jié)子基因過表達對血紅素合成途徑關鍵基因轉錄水平的影響

由于在生物體內血紅素的合成途徑是高度保守和嚴格調控的，并且會受到自身血紅素合成量的反饋調控。為了進一步分析過量表達鐵攝取調節(jié)子基因fur對血紅素合成途徑基因的影響，在轉錄水平對重組菌株的血紅素合成途徑的關鍵酶基因gltX、hemA、hemL、hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH的轉錄水平進行了實時熒光定量PCR，其基因轉錄水平的變化結果如圖10所示。

圖10 不同培養(yǎng)條件下重組菌株血紅素合成酶基因轉錄水平變化Fig.10 Transcription level of the heme synthase gene of recombinant strains under different culture conditions

由圖10可以看出，兩種培養(yǎng)條件下重組菌株Eco/pEF中過表達的基因fur的轉錄水平顯著提高，說明基因得到成功表達。此外，LB培養(yǎng)條件下，fur基因的過表達使得大部分血紅素合成途徑基因的轉錄水平發(fā)生不同程度的上調，其中上調水平變化較大的是gltX、hemB、hemC，分別上調了4.93倍、4.61倍和9.39倍；血紅素合成途徑的最后一個限速步驟中的關鍵酶基因hemH的轉錄水平輕微上調，同時發(fā)現另一個限速步驟中的關鍵酶基因hemA的轉錄水平下調，在血紅素合成途徑中(圖1)，hemA基因編碼的谷氨酰-tRNA還原酶催化谷氨酰-tRNA往下游合成ALA，ALA再往下游合成血紅素，當前體物質合成不足時，會影響下游血紅素的合成。因此，LB培養(yǎng)條件下，fur基因的過表達并未使血紅素合成量提高。

與此相反的是，限鐵條件下(LB+Dip)鐵攝取調節(jié)子基因fur的過表達使血紅素的合成相比于wild有所增加(圖9)，由圖10可知，血紅素合成途徑的關鍵酶基因的轉錄水平都處于不同程度的上調狀態(tài)，以基因hemB與hemG上調最為明顯，分別上調了5.59和4.49倍，同時發(fā)現基因hemL與hemH分別上調了2.60與2.40倍?；騢emB編碼的ALA脫水酶催化前體物質ALA合成膽色素原，膽色素原再經酶促反應合成血紅素的前體卟啉物質，基因hemG編碼的原卟啉原Ⅸ氧化酶催化原卟啉原Ⅸ合成原卟啉Ⅸ；基因hemH編碼的亞鐵鰲合酶催化原卟啉Ⅸ合成血紅素(圖1)。因此，限鐵條件下鐵攝取調節(jié)子基因fur的過表達使血紅素的合成量有所增加，以維持細胞正常的生理活動。

同時，以上結果也表明血紅素的合成受到嚴格的調控，Fur蛋白、鐵離子及血紅素合成途徑基因的表達三者之間相互影響與作用，共同調控血紅素的合成。

3 討論

鐵是血紅素的重要組成部分，也是生物生長代謝的必需元素，其表達調控受多種因素的制約[21-23]。鐵攝取調節(jié)子Fur對鐵有全局調控作用，而在血紅素合成的最后一步中，需要在亞鐵鰲合酶的作用下鰲合鐵離子生成血紅素。已有研究表明Fur同系物FurA蛋白調控魚腥藻(Anabaenasp.)的鐵穩(wěn)態(tài)和血紅素合成[24]。通過過表達和轉錄分析，GONZALEZ等[25]發(fā)現FurA抑制Anabaenasp.的hemB與hemC表達，同時激活hemH的表達。本研究結果表明,與魚腥藻不同，大腸桿菌fur基因的過量表達抑制了hemA的表達，顯著上調了gltX、hemB、hemC的表達，而限鐵條件下hemB進一步上調，由此可見，以gltX、hemA、hemB、hemC為靶點，結合Fur與鐵的調控，可為控制E.coli胞內血紅素的含量提供一個新的策略。

此外，fur對需要血紅素參與的細胞生理過程和以血紅素為輔基的蛋白表達也會產生顯著影響。FU等[26]發(fā)現在奧奈達希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)的fur突變菌株中，血紅素b的合成、細胞色素c的水平以及細胞呼吸活性發(fā)生改變；COLPA等[27]在異源表達脫色過氧化物酶時發(fā)現，重組蛋白表達量的增加并未提升酶的活性，原因在于與重組酶結合的是缺乏鐵的血紅素前體原卟啉Ⅸ，而非血紅素。本研究結果表明，Fur的過量表達抑制了菌體的生長和血紅素的合成。Fur對鐵離子轉運系統(tǒng)的轉錄有抑制作用[17]，Fur的大量表達會抑制鐵離子的轉運，造成胞內鐵離子含量減少，進而限制了參與血紅素合成途徑最后一步的亞鐵螯合酶的作用。此外，由于血紅素及前體卟啉物質過多會對細胞產生毒害作用[28]，所以菌體生長受限，相應的血紅素需求減少，合成量降低。因此血紅素含量的變化是途徑中的基因表達水平、鐵離子濃度和菌體生長狀況的綜合體現。

綜上所述，Fur介導的血紅素合成調控對于細胞生長和代謝具有十分重要的意義。然而，不同微生物的調控機制存在差異，目前相關信息還十分有限。大腸桿菌作為模式菌株和常用的基因工程菌，深入研究其Fur、鐵和血紅素之間的相互關系，在血紅素包括其前體合成以及以血紅素為輔基的重組酶生產中具有潛在的應用價值。