賈晨晨,包煥玲,孟現(xiàn)堯,朱曉振,衣悅濤
(1.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所,山東煙臺264003;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京100049;3.山東東方海洋科技股份有限公司,山東煙臺264003)
近年來,我國刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。2017年我國刺參總產(chǎn)量達25萬噸,是海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱型產(chǎn)業(yè)(姜森顥等,2017)。但由于刺參缺乏特異性免疫,細菌性疾病對刺參危害極大。燦爛弧菌作為一種致病性嗜鹽細菌(馬愛敏等,2009),是引發(fā)刺參腐皮綜合征的主要致病菌。刺參感染燦爛弧菌后會造成極高的死亡率,制約了刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展(王印庚等,2004)。
為提高刺參抗病力,除了微生態(tài)制劑、中草藥成分添加劑改善刺參免疫能力外,利用益生元改善刺參腸道健康也是一種前景良好的新策略(趙倩等,2017;柳序等,2016)。研究證明,益生元能夠提高水產(chǎn)動物對營養(yǎng)的利用率,增強新陳代謝,并促進水產(chǎn)動物生長性能,增強其抗病能力(Guer reiro等,2017;Yang等,2016;Torrecillas等,2011),這些研究為益生元在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。
菊芋全粉微溶于水,制備成本低,其中含50%~60%的菊粉,菊粉作為水溶性益生元,具有調(diào)節(jié)腸道微生物組成、增強免疫和提高抗病能力等功能。因菊粉使用成本高,水溶性強,因此本試驗選用菊芋全粉作為益生元飼料添加劑應(yīng)用于刺參養(yǎng)殖中,研究其對刺參生長性能、燦爛弧菌刺激下刺參體腔液中相關(guān)免疫酶應(yīng)答變化的影響,以期為菊芋全粉在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用及刺參的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。
1.1 試驗動物 試驗所用刺參由山東東方海洋科技股份有限公司養(yǎng)殖場提供,初始體重為(4.7±0.1)g,將刺參飼養(yǎng)于40 L塑料質(zhì)水箱中,水溫(17±1)℃,pH(8.1±0.2),海水鹽度為27‰~29‰,每日投喂1次(16:00)飼料,投喂量為刺參體重的3%,每日采用虹吸法去除殘餌及糞便并換水30%。暫養(yǎng)1周后用于試驗。
1.2 試驗設(shè)計 暫養(yǎng)結(jié)束后,挑選360只健康刺參,隨機分為3組,每組6個平行,每個平行20只刺參,對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,試驗Ⅰ、Ⅱ組分別在基礎(chǔ)飼料中添加5 g/kg和15 g/kg菊芋全粉,飼養(yǎng)周期為28 d。日糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示。
表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平
1.3 燦爛弧菌感染試驗 28 d養(yǎng)殖試驗結(jié)束后進行感染試驗,試驗使用的燦爛弧菌經(jīng)活化后接種于2216E培養(yǎng)液中(梁超,2011),在30℃下培養(yǎng)24 h,調(diào)整菌液濃度為109cell/mL,用1 mL無菌注射器經(jīng)腹腔注射對刺參進行感染,每只注射量為0.1 mL。繼續(xù)投喂飼料。
1.4 測定指標(biāo)與方法
1.4.1 生長性能指數(shù)測定及分析 試驗前將各組刺參稱重并計算平均初重W0,分別在飼養(yǎng)試驗第28天時,將各組刺參禁食24 h后,稱重Wt,日增重(ADG)和飼料利用率(FCR)計算公式如下:
式中:t為飼養(yǎng)試驗天數(shù),d;F為刺參總攝食量,g。
1.4.2 免疫因子活力變化的測定 在感染試驗后第0、1、2、3、4、5天時分別從每組取出9只健康刺參,在冰盤上取出刺參體腔液,于4℃、3000 r/min離心10 min,取上清液于離心管中,置于-80℃冰箱中保存,用作體腔液免疫指標(biāo)的測定。
刺參體腔液樣品中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)活性采用試劑盒(南京建成公司)測定。
1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,當(dāng)P<0.05時為差異顯著。
2.1 菊芋全粉對刺參生長性能的影響 由表2可知,與對照組相比,試驗Ⅰ、Ⅱ組刺參的平均日增重和平均日攝食量差異不顯著(P>0.05);試驗Ⅱ組刺參的飼料利用率顯著高于對照組(P<0.05)。說明15 g/kg菊芋全粉能顯著提高刺參的飼料利用率。
2.2 菊芋全粉對燦爛弧菌刺激后刺參免疫因子應(yīng)答變化的影響
2.2.1 燦爛弧菌刺激后刺參ACP活力變化 測定結(jié)果顯示,燦爛弧菌刺激后,刺參的ACP活性呈先增加后降低的周期性變化,試驗Ⅰ組刺參ACP活力在第3天顯著高于對照組,而在第2、第4天卻顯著低于對照組(P<0.05);試驗Ⅱ組刺參的ACP活力在第3天時顯著高于對照組(P<0.05),其他時間與對照組無顯著差異(圖1)。
表2 菊芋全粉對刺參生長性能的影響
圖1 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中ACP活力變化
2.2.2 燦爛弧菌刺激后刺參AKP活力變化 由圖2可知,燦爛弧菌刺激后刺參AKP活力急劇增加,但隨著時間的延長AKP系統(tǒng)的應(yīng)答能力逐漸恢復(fù)到初始水平。這可能是由于AKP完成了對入侵燦爛弧菌的免疫應(yīng)答。此外,試驗Ⅱ組刺參AKP活力始終顯著高于對照組(P<0.05),結(jié)果表明在燦爛弧菌感染時,添加15 g/kg菊芋全粉可以顯著提高刺參AKP活力。
2.2.3 燦爛弧菌刺激后刺參SOD活力變化 由圖3可知,相較于對照組,試驗Ⅰ組刺參在細菌感染1 d后SOD活力顯著提高(P<0.05),之后下降并逐漸趨于初始水平;試驗Ⅱ組刺參在細菌感染第1天和第2天時SOD活力始終顯著高于對照組(P<0.05),并從第3天開始逐漸下降至初始水平。結(jié)果表明在燦爛弧菌刺激下,15 g/kg菊芋全粉對SOD活力的提高作用更為明顯。
2.2.4 燦爛弧菌刺激后刺參LYZ活力變化 如圖4所示,燦爛弧菌刺激后第1、2天,試驗Ⅱ組與對照組刺參LYZ活力受到抑制,而試驗Ⅰ組刺參LYZ活力顯著升高(P<0.05),并在第4天時恢復(fù)到初始水平。結(jié)果表明燦爛弧菌會抑制刺參的溶菌應(yīng)答反應(yīng),飼料中添加5 g/kg菊芋全粉可顯著改善這種抑制。
3.1 菊芋全粉對刺參生長性能的影響 關(guān)于益生元對水產(chǎn)動物生長性能的影響報道不一,有研究認(rèn)為并無顯著效果,也有研究證明益生元可改善水產(chǎn)動物的生長性能(Guerreiro等,2015;孫永欣等,2012;Ringo等,2010),這可能與益生元的種類、添加量及水產(chǎn)動物的種類、年齡、養(yǎng)殖方式等均有關(guān)系。本研究采用菊芋全粉作為益生元飼料添加劑,試驗結(jié)果表明,飼料中添加15 g/kg菊芋全粉可顯著提高刺參的飼料利用率,其原因可能是菊芋全粉會影響刺參腸道結(jié)構(gòu)或者消化酶活性,進而促進刺參的生長,提高其對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率,這與Abdelmalek等(2015)對海鱸魚的研究結(jié)果一致。本研究中菊芋全粉對刺參的ADG影響不大,可能是試驗周期短,其中機理仍需進一步研究。
3.2 菊芋全粉對燦爛弧菌刺激后刺參免疫因子應(yīng)答變化的影響 燦爛弧菌作為刺參腐皮病的主要病原菌,制約著刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。益生元作為功能性成分,可以改善水產(chǎn)動物腸道健康,進而增強機體免疫力。因此本研究將菊芋全粉作為益生元飼料添加劑應(yīng)用于刺參飼料中,研究其對燦爛弧菌刺激后刺參體腔液內(nèi)免疫因子如ACP、AKP、SOD及LYZ活力變化的影響。其中ACP是巨噬細胞溶酶體的標(biāo)志酶,可吞噬消化顆粒形異物(Meng等,2003)。本研究結(jié)果顯示燦爛弧菌感染時,ACP可有效應(yīng)答弧菌入侵,其活力呈現(xiàn)先增加后降低的周期性變化,這可能是由于ACP大量參與對弧菌的反應(yīng),使得ACP活力提高,隨后由于ACP大量消耗造成ACP活力暫時性下降,研究結(jié)果表明,15 g/kg菊芋全粉可抑制ACP活力降低的程度。AKP是一種對底物專一性要求較低的磷酸單脂水解酶,是重要的解毒系統(tǒng),并與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)(Zhang等,2000)。研究結(jié)果表明,15 g/kg菊芋全粉可顯著提高細菌感染時刺參AKP活力,劉云等(2008)用海藻硫酸多糖與殼聚糖喂養(yǎng)刺參,也得到了類似結(jié)果。SOD作為一種重要的抗氧化酶,主要參與清除體內(nèi)過量的自由基,同時在機體清除病原菌過程中增強自我防御功能,因此SOD活力是反映機體免疫力的重要指標(biāo)(董曉亮等,2013),本研究結(jié)果表明燦爛弧菌刺激后,刺參SOD活力呈現(xiàn)先升高后逐漸恢復(fù)至初始水平的趨勢,其中菊芋全粉添加量為15 g/kg時效果最佳,該結(jié)果與貽貝(Mytilus edulis)(Tanguy等,2013)的結(jié)果不同,燦爛弧菌并沒有抑制SOD系統(tǒng)的應(yīng)答能力,這可能與動物種類、年齡有關(guān)。LYZ通過水解革蘭氏陽性菌細胞壁中的乙酰氨基多糖,可破壞和消除入侵異物,從而起到殺菌防御功能(王淑嫻等,2010)。研究結(jié)果表明,燦爛弧菌入侵初期,對照組刺參LYZ活力受到抑制,這與叢聰(2015)的研究結(jié)果一致,但5 g/kg菊芋全粉組刺參LYZ活力卻顯著增強,這表明5 g/kg菊芋全粉在燦爛弧菌感染初期可顯著提高LYZ活力。
圖2 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中AKP活力變化
圖3 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中SOD活力變化
圖4 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中LYZ活力變化
日糧中添加15 g/kg菊芋全粉可顯著提高刺參的飼料利用率;燦爛弧菌刺激時能有效地提高刺參體液中ACP、AKP、SOD活力,而5 g/kg菊芋全粉可顯著提高燦爛弧菌誘導(dǎo)時刺參LYZ活力;綜上,本試驗條件下菊芋全粉的添加量為15 g/kg時,刺參的免疫因子活力提高效果顯著,因此菊芋全粉具備作為刺參免疫增強劑的潛在應(yīng)用價值。