孫婧文，朱嵩岳，尹 娜，伯 樂，吳晨婷，茅彩萍

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇 蘇州 215006)

全球約8%～12%的育齡夫婦患有不孕不育癥[1]，體外受精-胚胎移植術(shù)(invitrofertilization & embryo transfer，IVF-ET)為不孕不育患者帶來了生育的希望。過去40年，通過輔助生殖技術(shù)診治不孕不育的人數(shù)逐年增加，全球已有超過800萬的試管嬰兒誕生[2]。盡管輔助生殖技術(shù)已成功解決了不孕癥患者的生育需求，但近年來，IVF-ET子代的近期和遠(yuǎn)期健康風(fēng)險(xiǎn)引起了生殖醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[3]。因?yàn)镮VF-ET是一種非自然的受孕過程，隨著IVF-ET子代年齡的增長，許多成年發(fā)病的疾病開始顯現(xiàn)[4]。

世界衛(wèi)生組織(WHO)2016年報(bào)告的數(shù)據(jù)顯示：心血管疾病發(fā)病率高，也是全球最常見的死因，每年約可導(dǎo)致1 790萬人死亡，占全球總死亡人數(shù)的31%[5]。已有研究表明，IVF-ET子代存在內(nèi)分泌代謝紊亂、血管功能障礙等問題[3]。IVF-ET子代血壓輕微升高，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)明顯[3]。外周血管阻力在維持血壓方面也起著重要作用，但I(xiàn)VF-ET中年子代外周血管功能情況的數(shù)據(jù)鮮見報(bào)道?；谶@一現(xiàn)狀，本研究擬通過建立IVF-ET子代小鼠模型，探討IVF-ET在診治不孕不育中對(duì)其子代血管功能的影響，該研究結(jié)果為IVF-ET子代血管相關(guān)的易感疾病的預(yù)防和早期干預(yù)提供重要的實(shí)驗(yàn)理論信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂和♀野生型C57BL/6和ICR小鼠，8周齡，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，許可證號(hào)：SYXK(蘇)2017-0003。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)所有小鼠進(jìn)行2周的適應(yīng)性喂養(yǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間喂食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水，每日于7 ∶00～19 ∶00用燈光照明。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均按照中國蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)，購自寧波第二制藥廠；精子獲能液(Toyoda, Yokoyama, Hoshi medium，TYH)、人輸卵管液(human tube fluid，HTF)、CZB培養(yǎng)液(Chatot CL，Ziomek CA，Bavister BD medium，CZB)、KSOM培養(yǎng)液(potassium simplex optimization medium，KSOM)和M2培養(yǎng)液(M2 mouse embryo medium，M2)，購自南京愛貝生物科技有限公司；礦物油，購自瑞典Vitrolife公司；ELISA試劑盒，購自Sino-UK；抗β-actin、Calm2、Itpr1抗體，購自Abcam公司。

1.3 儀器常溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermo Fisher公司)；自動(dòng)凝膠圖像分析儀(上海培清科技有限公司)。

1.4 體外受精和胚胎培養(yǎng)選取10～12周齡♀ C57BL/6小鼠，通過腹腔注射5 IU(0.1 mL)PMSG刺激排卵。48 h后腹腔注射5 IU(0.1 mL)hCG。取12～14周齡的C57BL/6 ♂小鼠附睪尾內(nèi)的精子，置TYH培養(yǎng)液中，并在37 ℃、6% CO2的濕潤空氣中獲能50 min。在注射hCG 14 h后，從輸卵管中取出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物放入HTF培養(yǎng)液中。隨后取約106個(gè)已獲能精子加入HTF培養(yǎng)液中，在37 ℃和6% CO2環(huán)境下受精6 h。將KSOM和CZB培養(yǎng)液置于37 ℃、6% CO2環(huán)境中預(yù)平衡，所述培養(yǎng)液均用礦物油覆蓋。隨后，將受精卵轉(zhuǎn)移到25 μL的KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，胚胎4細(xì)胞時(shí)轉(zhuǎn)移進(jìn)CZB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段。最后將成熟囊胚移植到假孕的♀小鼠宮內(nèi)。

1.5 胚胎移植在胚胎移植前2.5 d，將至少8周齡的ICR ♀小鼠與輸精管結(jié)扎的♂小鼠合籠。交配后次日早晨檢查♀小鼠是否形成陰道栓。在胚胎移植之前，用三溴乙醇(240 mg·kg-1，腹腔注射)麻醉假孕♀小鼠，并且在每側(cè)子宮中植入5～7個(gè)胚胎，分娩產(chǎn)出的小鼠為實(shí)驗(yàn)組。經(jīng)自然交配出生的子代小鼠為對(duì)照組。妊娠期及哺乳期所有母鼠均給予標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和水。子代小鼠于4周齡時(shí)♀♂分籠。待實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組子代生長至中年(20～22周時(shí))，取♂用于實(shí)驗(yàn)。所有子代均來自不同母鼠，n代表小鼠數(shù)量。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 心血管功能相關(guān)的細(xì)胞因子檢測腹主動(dòng)脈取血樣，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用ELISA法，NO濃度測定采用比色法，并按照制造商的流程及說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。檢測血清血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)和前列腺素E2(prostaglandin，PGE2)濃度。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR檢測按照RNeasy Mini Kit(德國Qiagen)說明書的步驟，提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的子代小鼠腸系膜血管組織總RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa公司)將總RNA合成cDNA[6]。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)(TaKaRa公司)和mRNA引物(南京銳真生物有限公司)通過qPCR檢測Itpr1、Calm2、RyR2、RyR3及β-actin的mRNA的水平。反應(yīng)體系如下：95 ℃ 30 s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95 ℃ 5 s和60 ℃ 34 s。引物序列見Tab 1。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，用于mRNA表達(dá)分析的生物學(xué)重復(fù)數(shù)不小于3。

Tab 1 Primer sequences

1.8 蛋白提取和蛋白表達(dá)檢測采用Western blot法檢測來自腸系膜血管組織中Calm2和Itpr1的蛋白表達(dá)。取腸系膜動(dòng)脈血管組織液氮中研磨，與裂解液充分混勻，置于冰上靜置15 min，隨后放入4 ℃離心機(jī)中，12 000 r·min-1離心30 min，所獲蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，加封閉液于室溫封閉2 h后，按抗體說明書比例加入稀釋的一抗，4 ℃過夜。洗膜后加入稀釋二抗，室溫孵育1～2 h后，用TBST充分漂洗，而后行曝光等處理，并以β-actin為內(nèi)參照，采用Image J軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析。每組標(biāo)本重復(fù)檢測3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 IVF-ET對(duì)胚胎發(fā)育和產(chǎn)仔數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞率為(79.70±10.58)%，囊胚形成率為(80.25±12.67)%，實(shí)驗(yàn)組母鼠的產(chǎn)仔數(shù)為(3.14± 1.21)，明顯低于對(duì)照組(5.66± 0.78)(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 IVF-ET對(duì)子代小鼠體長、體質(zhì)量和BMI的影響如Fig 1所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠體長為(10.35± 0.36)cm，與對(duì)照組體長(10.18± 0.17)cm比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠的體質(zhì)量為(36.65± 4.94)g，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組BMI為(3.41± 0.33)kg·m-2，對(duì)照組為(2.93± 0.05)kg·m-2，實(shí)驗(yàn)組BMI明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。

Fig 1 Effects of IVF-ET on body length(A),

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 IVF-ET對(duì)血清AngⅡ、NO、ET-1和PGE2水平的影響Tab 2結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組血清AngII水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組血清NO濃度明顯低于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組血清ET-1、PGE2水平與對(duì)照組相比差異無顯著性(P>0.05)。

Tab 2 Serum concentration of AngⅡ, NO, ET-1 and PGE2 n=6)

*P<0.05vscontrol

2.4 IVF-ET對(duì)子代小鼠腸系膜血管Ca2+信號(hào)通路基因表達(dá)的影響考慮到Ca2+信號(hào)通路在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞血管收縮方面具有重要作用，本研究選擇了4個(gè)代表性基因，包括Itpr1、Calm2、RyR2和RyR3進(jìn)一步研究。Fig 2的qPCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Itpr1、Calm2、RyR3 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，而RyR2 mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。

Fig 2 Relative mRNA expression of Calm2, Itpr1, Ryr2 and Ryr3 detected by qPCR n= 3)

**P<0.01vscontrol

2.5 IVF-ET對(duì)腸系膜血管Itpr1和Calm2受體蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腸系膜血管Itpr1和Calm2受體蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。

Fig 3 Relative protein expression of Calm2 and Itpr1 detected by Western bolt n= 3)

**P<0.01vscontrol

3 討論

IVF-ET問世以來，越來越多的不孕夫婦通過該技術(shù)圓了生育子女的夢想。然而，人們對(duì)這一技術(shù)的安全性及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)知之甚少。盡管一些研究表明，IVF-ET不會(huì)增加子代長期的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[7]。也有研究報(bào)道，在表現(xiàn)正常的IVF-ET年輕子代中發(fā)現(xiàn)血管功能障礙、血管衰老和高血壓，這可能使其過早地患上心血管疾病[8]。大部分研究都主要針對(duì)IVF-ET對(duì)大血管和心臟造成的影響，而有關(guān)中年子代長期血管風(fēng)險(xiǎn)的數(shù)據(jù)仍然缺乏。本研究提示，IVF-ET可能對(duì)中年子代小血管功能及其調(diào)節(jié)功能存在影響。

IVF-ET過程中為了獲取多個(gè)同步發(fā)育的卵泡，臨床常用高濃度促性腺激素刺激排卵，而對(duì)超過正常生理濃度促性腺激素的影響，尤其是對(duì)卵子/胚胎發(fā)育及子代健康影響的研究仍有空白。本實(shí)驗(yàn)通過模擬臨床IVF-ET過程，使用高濃度的PMSG，目的是通過實(shí)驗(yàn)探討其對(duì)子代血管相關(guān)的生物活性物質(zhì)及血管功能相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響及其機(jī)制。

已有報(bào)道[9]，IVF-ET子代易患肥胖癥和高血壓。本研究數(shù)據(jù)顯示，在相同的正常飲食下，實(shí)驗(yàn)組BMI明顯高于對(duì)照組。與先前采用FVB[10]和ICR小鼠[9]的研究結(jié)果一致。本研究提示，BMI的上調(diào)可能與IVF-ET誘導(dǎo)的胚胎表觀遺傳變化，以及生命后期的環(huán)境因素有關(guān)[10]。并且IVF-ET可能改變了參與體質(zhì)量調(diào)控的相關(guān)基因。鑒于BMI是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，IVF-ET子代BMI的升高會(huì)增加代謝和心血管疾病的可能性。

腸系膜血管是重要的阻力血管，在調(diào)控和維持血壓中起重要作用。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞可釋放NO、AngⅡ、ET-1等生物活性物質(zhì)，參與血管功能和體內(nèi)代謝平衡的調(diào)節(jié)[11]。內(nèi)皮功能障礙會(huì)導(dǎo)致血管舒縮功能障礙、內(nèi)皮通透性增加等，可增加心血管疾病發(fā)生的可能性。尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可導(dǎo)致高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等血管損傷性疾病。ET-1是一種強(qiáng)縮血管物質(zhì)，同時(shí)具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞分裂增殖的作用。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)對(duì)血管收縮功能具有重要影響，而AngⅡ是RAAS系統(tǒng)中的重要活性物質(zhì), 也是一種強(qiáng)效的縮血管活性物質(zhì)。

已有的實(shí)驗(yàn)研究顯示，遺傳和環(huán)境因素可相互影響，并共同作用于血管NO合成和血壓穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET子代的血清NO濃度明顯低于對(duì)照組，提示體外培養(yǎng)液以及IVF-ET操作過程會(huì)對(duì)子代小鼠的血管功能產(chǎn)生不利影響。雖然這些發(fā)現(xiàn)的基本機(jī)制尚不清楚，但有證據(jù)表明，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是鈣信號(hào)通路調(diào)控十分重要的基因。由eNOS合成的NO能調(diào)節(jié)血管張力，抑制血小板黏附與聚集，改善血管內(nèi)皮舒張功能。eNOS的作用依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞Calm2表達(dá)發(fā)生改變時(shí)，將會(huì)影響eNOS功能出現(xiàn)障礙, 此時(shí)eNOS合成NO減少，造成NO生物利用度降低及氧化應(yīng)激增加, 導(dǎo)致或加重內(nèi)皮功能障礙，并且IVF-ET誘導(dǎo)的心血管表型變化與eNOS功能改變有關(guān)[13]。此前的報(bào)道顯示，與對(duì)照組相比，IVF-ET子代的血管一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性明顯降低[10]。由此推斷這種功能上的差異與Ca2+及其信號(hào)通路的作用有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET子代腸系膜血管組織中Calm2基因的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，證實(shí)了上述假設(shè)。由此推斷，Calm2基因的異常表達(dá)可能導(dǎo)致IVF-ET子代的血管功能障礙。

最新研究表明[14]，Itpr1介導(dǎo)的Ca2+釋放可能在調(diào)節(jié)血管收縮和AngII誘導(dǎo)的高血壓及血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。AngⅡ與AT1受體結(jié)合后，通過激活鳥苷酸(GMP)結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白，繼而產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上IP3受體(Itpr1)結(jié)合，同時(shí)L型鈣通道激活后，使細(xì)胞攝入鈣和肌漿網(wǎng)釋放Ca2+增多，導(dǎo)致血管功能異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中檢測到Itpr1高表達(dá)，證實(shí)了其在整個(gè)生存期間對(duì)血管收縮的影響。本研究數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組RyR2、RyR3的表達(dá)水平存在很大差異。眾所周知，Itpr1和RyR3的表達(dá)升高可能通過鈣信號(hào)通路導(dǎo)致Calm2表達(dá)升高。在所有這些改變的共同作用下，IVF-ET可能會(huì)對(duì)子代血管調(diào)節(jié)功能產(chǎn)生不利影響。由此認(rèn)為，當(dāng)遇到高碳水化合物飲食、高脂肪飲食以及其他不健康的生活方式時(shí)，這種相互作用帶來的不利后果將更加嚴(yán)重。

由于與體外受精-胚胎移植相關(guān)的多種因素的存在，目前尚無法證明IVF-ET過程導(dǎo)致的影響是否可獨(dú)立于母體環(huán)境，并成為成年疾病發(fā)生、發(fā)展的主要影響因素。今后將繼續(xù)研究IVF-ET中多個(gè)操作步驟等對(duì)子代生命健康的影響，并進(jìn)一步研究老年子代，以獲得更多關(guān)于IVF-ET對(duì)子代長期影響的數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究顯示，IVF-ET子代存在肥胖的傾向及血管相關(guān)的如高血壓等疾病的易感性。本研究首次提出IVF-ET對(duì)子代高血壓相關(guān)的一組基因Itpr1、Calm2的表達(dá)，以及對(duì)中老年小鼠微血管功能調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響，為進(jìn)一步研究IVF-ET影響子代高血壓的相關(guān)機(jī)制提供了重要信息和理論依據(jù)，為預(yù)防及早期采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施，避免IVF-ET子代血管相關(guān)疾病的發(fā)生提供了重要的科學(xué)指導(dǎo)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室各位老師、同學(xué)的指導(dǎo)和幫助表示衷心的感謝！)