孟劉坤，滕 曉，袁 雯，孟 健，李 君，劉曉艷

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心阜外醫(yī)院 心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100020)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種由異源性疾病以不同發(fā)病機(jī)制引起的，以肺小動(dòng)脈進(jìn)行性重構(gòu)和肺血管阻力持續(xù)增加為特征的臨床綜合征[1]，具有潛在致死性，是繼冠脈綜合征、高血壓之后最常見的心血管病綜合征。研究發(fā)現(xiàn)，肺動(dòng)脈細(xì)胞組份重獲增殖潛能導(dǎo)致的肺血管持續(xù)性重構(gòu)是PAH的主要病理改變，表現(xiàn)為無(wú)肌層肺小動(dòng)脈肌化，肌性肺動(dòng)脈中膜肌層增厚，特征性的肺小動(dòng)脈新生內(nèi)膜和叢狀病變的形成[2]。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤抑瘤蛋白1(neuroblastoma suppression of tumorigenicity 1，NBL1)在正常肺組織中表達(dá)水平最高，而其在肺組織發(fā)育及病理狀態(tài)下的作用至今未知[3-5]。腫瘤方面的研究發(fā)現(xiàn)，NBL1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有重要的調(diào)節(jié)作用[6-9]，但NBL1對(duì)肺動(dòng)脈細(xì)胞的影響至今未知。因此，我們推測(cè)NBL1或參與了PAH的肺血管重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)擬研究野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織和血漿中NBL1的水平及變化趨勢(shì)，為探討其在肺血管重構(gòu)中的作用及作為PAH潛在的生物標(biāo)志物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，♂，體質(zhì)量(200±10)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，均在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.1.2試劑 MCT (Sigma公司)；TRIzol (Invitrogen公司)；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物(TaKaRa生物工程有限公司)；抗NBL1抗體(Proteintech公司)；抗p-Smad1/5/8抗體(Cell Signaling Technology公司)；抗Smad1/5/8抗體(Santa Cruz公司)；抗GAPDH抗體(Abmart公司)；二辛可酸蛋白定量試劑盒(Abcam公司, ab102536)；NBL1 ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D公司, DY955)；Power SYBR green PCR mastermix (ABI公司)；重組人BMP-2、重組人BMP-4(R&D公司)。

1.1.3儀器 Inspria ASVP小動(dòng)物呼吸機(jī)(Harvard Apparatus公司)；Powerlab 16/30生理記錄儀(AD Instruments公司)； 奧德賽紅外成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1MCT誘導(dǎo)的PAH動(dòng)物模型的制備 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、野百合堿3周組(MCT-3W)、野百合堿4周組(MCT-4W)、野百合堿5周組(MCT-5W)，每組10只。分別腹腔注射無(wú)菌生理鹽水或MCT 60 mg·kg-1。腹腔注射后，SD大鼠置于恒溫室內(nèi)飼養(yǎng)(21 ℃，相對(duì)濕度50%～70%)，不限食水。本研究相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)，NO. 0000502)。

1.2.2肺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測(cè)量 MCT組注射MCT后3～5周，以及Control組注射生理鹽水后5周，行右心導(dǎo)管測(cè)量肺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)[10-11]。將13 cm長(zhǎng)、尖端彎曲的聚乙烯右心導(dǎo)管(外徑0.9 mm，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)所病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)用肝素生理鹽水預(yù)充后，一端連于Powerlab 16/30，一端緩慢送入右側(cè)頸外靜脈、右心房、右心室和肺動(dòng)脈主干，記錄肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(右心室收縮壓、肺動(dòng)脈收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓)，右心導(dǎo)管的具體位置以上述部位的典型壓力波形和波幅來確定。

1.2.3大鼠血漿NBL1濃度的測(cè)定 右心導(dǎo)管測(cè)壓完成后，用采血針經(jīng)下腔靜脈采血2 mL, EDTA抗凝，4 ℃靜置0.5 h后，3 000 r·min-1離心15 min；吸取上清，分裝保存于-80 ℃冰箱備用。大鼠血漿NBL1濃度的測(cè)定分別使用雙抗體夾心法ELISA試劑盒，檢測(cè)范圍分別為62.5～4 000 ng·L-1。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4心肺組織取材及右室肥厚指數(shù)的計(jì)算 肺血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量后，以4 ℃ PBS經(jīng)下腔靜脈快速?zèng)_洗心肺組織，沖洗完畢后，迅速整體剪下心肺組織置于冰塊上；剪下左肺上部，存放于凍存管后，迅速放于-80 ℃液氮中保存，以備后續(xù)qPCR和Western blot檢測(cè)NBL1表達(dá)水平的變化；余肺置于10%中性福爾馬林常溫固定24 h，流水沖洗12 h，制成肺組織蠟塊，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)NBL1的肺組織定位。

取出心臟，生理鹽水沖凈，去除左右心房及相連大血管, 將右心室(right ventricular, RV)、左心室(left ventricular, LV)及室間隔(interventricular septum，IVS)剪下，濾紙吸干后稱重。按如下公式計(jì)算右室肥厚指數(shù)(fulton index): Fulton index=RV/(LV+IVS)。

1.3 體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)于ScienCell公司，將液氮中凍存的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇及傳代，置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，以完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。將2～3代的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至融合率達(dá)到80%～90%后，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。分為4組：對(duì)照組、BMP-2/4(20 μg·L-1)刺激組、NBL1(100、2 000 μg·L-1)+BMP-2/4(20 μg·L-1)組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRIzol法提取肺組織總RNA，取純化的RNA 1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qPCR方法檢測(cè)NBL1 mRNA的表達(dá)變化[12]。各引物序列如下: NBL1正向引物5′-CCACAGGATGCCTGAAGATGAA-3′, 反向引物5′-AGGTTAGCCTGGGCAGGATTG-3′; GAPDH正向引物5′-GGCACAGTCAAGGCGAGAATG -3′, 反向引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)提取制備肺組織或肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白樣品，二辛可酸法測(cè)定蛋白樣品濃度后，各肺組織標(biāo)本取50 μg蛋白，100 ℃加熱5 min蛋白變性，然后4%～12%的Nu-PAGE預(yù)制膠上行電泳分離蛋白質(zhì); 經(jīng)半干轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂牛奶常溫下封閉1 h，一抗 (抗NBL 1 ∶500，抗GAPDH 1 ∶5 000) 4 ℃搖床孵育過夜; 洗膜緩沖液漂洗后，加入IRDye 680二抗 (1 ∶1 000)，室溫下反應(yīng)1 h后，TBST再次洗滌，使用奧德賽紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.6 免疫組織化學(xué)染色取肺組織蠟塊，切片(2～4 μm)，貼片, 二甲苯透明及無(wú)水乙醇梯度脫水，PBS洗滌，5 min×3次，100 ℃沸水中高壓修復(fù)抗原; 滴加Triton X-100(體積分?jǐn)?shù)0.3%)破細(xì)胞膜，并孵育20 min; 山羊血清封閉非特異性位點(diǎn)20 min后，滴加抗NBL1一抗 (1 ∶400)，4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫45 min, PBS洗滌，5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗 (1 ∶400)，37 ℃孵育1 h; PBS洗滌，5 min×3次，DAB顯色液顯色5～10 min，顯微鏡下掌握好顯色程度，流水沖洗10 min終止顯色; 蘇木精復(fù)染2 min；1%鹽酸乙醇分化20 s；流水沖洗10 min；乙醇梯度脫水；二甲苯透明；封片，鏡檢拍片(顯棕褐色者為陽(yáng)性)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體存活情況與PAH模型程度的評(píng)估注射操作未引發(fā)相關(guān)死亡。Control組飼養(yǎng)過程中無(wú)死亡；MCT-3W組死亡1只，MCT-4W組死亡3只，MCT-5W組死亡4只，尸檢發(fā)現(xiàn)胸腔積液，肝臟淤血硬化，死亡原因考慮為心力衰竭，剩余的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活至取材時(shí)間，右心導(dǎo)管測(cè)壓過程無(wú)操作相關(guān)死亡，相應(yīng)數(shù)據(jù)全部包括在最后的數(shù)據(jù)分析中。

腹腔注射MCT 3周～5周期間，MCT組的肺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(右室收縮壓、肺動(dòng)脈收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓)和右心室肥厚程度均較對(duì)照組大鼠明顯升高，且這種升高表現(xiàn)為時(shí)間依賴的漸進(jìn)性升高(Tab 1)。提示MCT在SD大鼠上成功誘導(dǎo)出典型的PAH疾病狀態(tài)，能很好地模擬PAH的病理生理學(xué)狀態(tài)。

2.2 NBL1 mRNA在PAH大鼠肺組織中的表達(dá)變化如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織NBL1 mRNA水平呈時(shí)間依賴性的降低，MCT注射后3周開始, SD大鼠肺組織NBL1 mRNA水平開始明顯降低，3周、4周、5周時(shí)較對(duì)照組分別下降70%、81%和89%。

Tab 1 Hemodynamic indices and right ventricular hypertrophy index of rats

RVSP: right ventricular systolic pressure value; PASP: pulmonary artery systolic pressure value; mPAP: mean pulmonary artery pressure value; Fulton index: right ventricular hypertrophy index.**P<0.01vscontrol.

Fig 1 Changes of NBL1 mRNA levels in MCT induced PAH rat lungs

##P<0.01vscontrol group.

2.3 NBL1蛋白在PAH大鼠肺組織中的表達(dá)變化如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織NBL1的蛋白水平呈時(shí)間依賴性的降低，MCT注射后3周開始, SD大鼠肺組織NBL1蛋白水平較對(duì)照組開始降低，5周時(shí)幾乎檢測(cè)不到。

Fig 2 Expression trend of protein level of NBL1 in rat lungs with MCT-induced PAH

##P<0.01vscontrol group

2.4 NBL1在MCT誘導(dǎo)的PAH肺組織中的變化趨勢(shì)免疫組織化學(xué)染色顯示(Fig 3)，NBL1在正常肺組織肺小動(dòng)脈管壁中強(qiáng)表達(dá)，但在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中，中膜肥厚的肺小動(dòng)脈管壁中僅檢測(cè)到微弱的NBL1表達(dá)。

Fig 3 Localization of NBL1 protein in pulmonary arterioles (×1000)

A: Normal pulmonary artery in lungs from control group; B: Pulmonary artery with mild thickened media in lungs from MCT-5 weeks group; C: Pulmonary artery with severe thickened media in lungs from MCT-5 weeks group.

2.5 NBL1血漿濃度在PAH大鼠中的變化趨勢(shì)Fig 4的ELISA結(jié)果顯示，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠NBL1血漿濃度較對(duì)照組呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性的明顯降低。Fig 5的相關(guān)性分析顯示，大鼠血漿NBL1濃度與右心導(dǎo)管測(cè)定的右心室收縮壓(r=-0.762 2，P<0.01)、肺動(dòng)脈收縮壓(r=-0.767 1，P<0.01)、平均肺動(dòng)脈壓(r=-0.789 6，P<0.01)及右室肥厚指數(shù)(r=-0.812 9，P<0.01)均呈明顯負(fù)相關(guān)。

Fig 4 Change trend of plasma concentration of NBL1 in rats

##P<0.01vscontrol group

2.6 NBL1抑制BMP2/4誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Smad 1/5/8信號(hào)通路的激活為了明確NBL1在PAH發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，我們進(jìn)行了細(xì)胞水平的研究。與預(yù)期一致，BMP2/4能誘導(dǎo)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Smad 1/5/8的磷酸化，提示肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞BMP信號(hào)通路的激活；而NBL1則濃度依賴性地抑制BMP2/4引起的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Smad 1/5/8的磷酸化，提示NBL1能抑制BMP信號(hào)通路的激活。見Fig 6。

Fig 5 NBL1 plasma concentration presented a negative correlation with extent of PAH in rats with MCT-induced PAH

3 討論

PAH是炎癥、低氧、體-肺分流、基因突變等原因引起的，以肺血管嚴(yán)重重構(gòu)導(dǎo)致肺血管阻力增高為特征的慢性致死性疾病[1]。研究已發(fā)現(xiàn)眾多導(dǎo)致PAH的分子機(jī)制，信號(hào)通路靶向藥物也已用于臨床治療，PAH患者的癥狀雖有改善，但患者的病死率并未明顯改善[2]，說明PAH研究領(lǐng)域中尚有未被闡明的發(fā)病機(jī)制。

NBL1是一種普遍存在于哺乳動(dòng)物組織和體液中的分泌型蛋白質(zhì)，起初在大鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型中發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤作用[3]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，NBL1的表達(dá)水平在一些表型轉(zhuǎn)換的細(xì)胞中明顯下調(diào)，而NBL1的過表達(dá)則抑制靜止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的S期[4,9]。因此，NBL1或是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其下調(diào)或缺失或可導(dǎo)致細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換。而肺動(dòng)脈細(xì)胞組份表型的轉(zhuǎn)換，即從靜止的、非可遷移的分化表型轉(zhuǎn)化為增殖、可遷移的合成或分泌表型，是PAH進(jìn)展的主要特點(diǎn)[13]。因此，我們推測(cè)NBL1在PAH肺組織和血漿中的變化，可能參與了PAH的發(fā)生和發(fā)展。

目前，PAH研究中多采用MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH模型，此模型制備簡(jiǎn)單，進(jìn)展迅速，且個(gè)體間PAH程度較均一。另外，在此模型上，先前的研究發(fā)現(xiàn)了PAH的諸多發(fā)病機(jī)制，因此，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型是可靠的PAH動(dòng)物模型[11, 14]。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射MCT 3周后，SD大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(右室收縮壓、肺動(dòng)脈收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓)及右室肥厚指數(shù)均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的明顯升高，證明MCT誘導(dǎo)的PAH模型制備成功。在此基礎(chǔ)上，我們研究了NBL1水平在MCT誘導(dǎo)的PAH肺組織和血漿中的變化趨勢(shì)及其臨床意義。

Fig 6 NBL1 inhibited activation of BMP signal of pulmonary artery endothelial cells induced by BMP2/4 n=3)

A: NBL1 dose-dependently inhibited BMP-2 induced Smad 1/5/8 phosphoralation; B: NBL1 dose-dependently inhibited BMP-4 induced Smad 1/5/8 phosphoralation.##P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsBMP4 group.

先前的研究發(fā)現(xiàn)，除肝臟外，NBL1在多種組織器官中均有表達(dá)，當(dāng)然表達(dá)的水平不盡相同，其中肺組織的表達(dá)最高[3-5]，提示其在肺組織中存在特異性表達(dá)的可能，但NBL1在肺組織發(fā)育及病理狀態(tài)下的作用至今沒有研究。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織NBL1的mRNA水平和蛋白水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的逐步降低，且在正常肺組織中，NBL1在肺小動(dòng)脈管壁中高表達(dá)，而在重構(gòu)的肺小動(dòng)脈中幾乎檢測(cè)不到NBL1的表達(dá)。BMP受體Ⅱ的致病性突變及BMP信號(hào)通路活性的下降，在PAH的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[15-16]。我們的結(jié)果表明，在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，NBL1可以拮抗BMP-2和BMP-4刺激Smad 1/5/8磷酸化的作用，提示NBL1可拮抗肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中BMP信號(hào)通路的激活。本研究發(fā)現(xiàn)，MCT注射后，肺組織NBL1表達(dá)水平逐步降低，理論上講，會(huì)減弱其對(duì)BMP信號(hào)通路的抑制作用，有拮抗炎癥性PAH進(jìn)展的潛在作用。目前，臨床工作中常用心臟超聲、右心導(dǎo)管及肺活檢來評(píng)價(jià)PAH程度，近來生物標(biāo)志物在PAH領(lǐng)域的研究結(jié)果令人鼓舞，有望在PAH的臨床篩選、診斷、預(yù)后評(píng)估及隨訪等方面發(fā)揮重要作用[15]。因此，尋找PAH的生物標(biāo)志物，協(xié)助準(zhǔn)確界定PAH程度，可為PAH的臨床干預(yù)提供可靠的理論依據(jù)。本研究的ELISA結(jié)果表明，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠模型中，NBL1的血漿濃度亦隨MCT注射后時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，且與肺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和右室肥厚指數(shù)均呈明顯負(fù)相關(guān)，提示NBL1血漿濃度可反映PAH嚴(yán)重程度，但PAH病人NBL1血漿濃度的變化尚無(wú)研究報(bào)道。因此，NBL1作為PAH臨床生物標(biāo)記物的可行性尚需進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺組織及血漿中，NBL1的水平隨著PAH的發(fā)生、發(fā)展而逐漸降低, 與PAH嚴(yán)重程度呈明顯的相關(guān)性, 說明NBL1血漿水平或是PAH潛在的生物標(biāo)志物。