吳紫君，楊超燕，張錦紅，古熾明，唐春萍，江 煒，鄒國發(fā)，黃 娟，陳艷芬,4

(1. 廣東藥科大學中藥學院，2. 廣東藥科大學實驗動物中心，3. 廣東省中醫(yī)院外二科， 4. 廣州市新藥篩選模型體系構建與應用重點實驗室，廣東 廣州 510006)

皮膚癬菌感染在人群中發(fā)病率高，近年來，由于廣泛應用抗生素、免疫抑制劑以及放療、化療等原因，發(fā)病率更呈不斷上升趨勢。紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)是臨床引起皮膚癬菌病最常見的真菌之一，其所致癬菌病病程長、難治愈、易復發(fā)[1-2]，世界各地均有散在的致病報道，但主要集中在北非和東南亞。隨著真菌感染率的不斷升高和現有抗真菌藥物耐藥性的日趨嚴重，臨床上對高效低毒的新型抗真菌藥物的需求日益迫切，而穩(wěn)定可靠的動物模型是新藥研發(fā)中必不可少的條件。我們近年研究發(fā)現，紅色毛癬菌皮膚感染動物模型造模方法不一致，成功率低，而且缺乏模型的綜合評價指標體系，各種造模方法相互之間可比性較差[3-8]。因此，急需建立一個科學的、量化的真菌感染動物模型評價指標體系，系統(tǒng)進行方法學評價。

層次分析法(analytic hierarchy process，AHP)是一種實用的多準則決策法，適合用于評價目標值難于定量描述、指標分層交錯的目標系統(tǒng)的決策問題，它把定性分析與定量分析有機地結合起來，把多目標、多準則、難定量的決策問題轉化為多層次、單目標、可量化的問題，最后通過簡單的計算，獲得簡明的結果[9]。本研究首先采用AHP建立紅色毛癬菌皮膚感染動物模型評價指標體系，再以此體系綜合考察評價一種動物模型需要考慮的多方面特征，包括科學性、可靠性、重復性、經濟性、易操作性等，由此優(yōu)選出理想的動物模型，為真菌皮膚感染機制研究及抗真菌感染新藥藥效學評價提供參考依據。

1 材料

1.1 試劑紅色毛癬菌標準株CMCC(F)T1d，購自中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所(南京)；曲安奈德注射液(昆明積大制藥股份有限公司，批號：170616)；地塞米松磷酸鈉注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號：51705222)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)(海博生物技術有限公司，批號：20171128)；豚鼠免疫球蛋白M(IgM)酶聯免疫吸附測定試劑盒(上海將來實業(yè)股份有限公司，批號：Mar 2018)；屈臣氏絲滑柔和脫毛膏(廣州市花安堂生物科技有限公司，批號：G0405G1)。

1.2 儀器SW-CJ-1F潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；SW-CJ-1F電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司)；H1850R醫(yī)用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；ELX800全自動酶標儀(Biotek Instruments)；QC5130電推剪(Lassie’s Trading Company Ltd)。

1.3 實驗動物普通級Hartley豚鼠，體質量(220～300) g，♀♂各半，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2014-0035，動物飼養(yǎng)于廣東藥科大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 建立綜合評價指標體系按照AHP的基本原理和建模步驟[9]，首先通過文獻調研和專家咨詢，搜集紅色毛癬菌感染豚鼠模型的評價指標并設計評價指標調查表，考察各個指標的科學性、必要性和重要性，確立紅色毛癬菌感染豚鼠模型的樹狀指標體系。采用德爾菲法，邀請5位專家對樹狀指標體系各層各指標相對重要性進行評分，建立判斷矩陣，采用和積法計算出各指標權重并檢驗矩陣一致性，綜合專家們的評分得出平均指標權重；進一步根據專家對各個詳細指標評分項的評價，匯總得出模型評價指標賦分標準，結合指標權重和賦分準則，最終建立紅色毛癬菌感染豚鼠模型的綜合評價指標體系。

2.2 構建動物模型

2.2.1制備菌懸液 參考實驗室前期基礎，將紅色毛癬菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱(28 ℃)培養(yǎng)14 d至對數生長期，用接種環(huán)輕輕刮取表面菌落移至研磨器，加入適量無菌生理鹽水，研磨成均勻的混懸液后用血球計數板計數，用生理鹽水調整濃度至1×1011cfu·L-1備用。

2.2.2動物分組造模 普通級Hartley豚鼠按體質量隨機分成7組，每組12只，♀♂各半。1組空白對照組：不給予任何特殊處理，接種或注射時給予等體積的生理鹽水；2組：接菌前后注射生理鹽水，背部皮膚接種上述菌懸液1 d(400 μL)[3,8]，d 2接種等體積的生理鹽水；3組：接菌前后注射生理鹽水，背部皮膚接種上述菌懸液2 d(200 μL·d-1)；4組：接菌前注射曲安奈德(20 mg·kg-1·d-1)3 d，接菌1 d(400 μL)，d 2接種等體積的生理鹽水，接菌后隔天注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)，共4次[4,6]；5組：接菌前注射曲安奈德(20 mg·kg-1·d-1)3 d，接菌2 d(200 μL·d-1)，接菌后隔天注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)，共4次；6組：接菌前注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)3 d，接菌1 d(400 μL)，d 2接種等體積的生理鹽水，接菌后每天注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)4 d；7組：接菌前注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)3 d，接菌2 d(200 μL·d-1)，接菌后每天注射地塞米松(7.5 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)4 d。其中，曲安奈德注射液為肌肉注射，地塞米松磷酸鈉注射液為腹腔注射。見Tab 1。

Tab 1 Animal grouping

豚鼠按分組預處理，接菌前24 h用電推剪剃去豚鼠背部毛發(fā)，再用脫毛膏清除毛根得到裸露光滑的背部皮膚。接菌前，脫毛部位用酒精消毒，待酒精揮干后，用無菌粗砂紙磨損皮膚至點狀滲血，在3 cm×3 cm的破損皮膚上均勻涂抹菌懸液，待菌液完全吸收后放回鼠籠，分組處理。接菌后，每天觀察和記錄各組的體征和實驗區(qū)域皮膚的紅斑、鱗屑和毛發(fā)的外觀變化，d 4開始，隔天拔取豚鼠少量毛發(fā)或皮屑，10% KOH直接鏡檢以檢查真菌陽性率。結束免疫抑制劑處理后，豚鼠眼眶前眥采血，采用ELISA法測定血清中IgM含量。d 14拔取豚鼠的毛發(fā)和鱗屑，接種于PDA培養(yǎng)基進行逆培養(yǎng)，以檢查真菌陽性率。根據各組的病程發(fā)展，各組在病程的前期、中期和后期隨機挑選2～3只，取其病變部位皮膚進行PAS染色和HE染色。實驗結束當天，解剖取脾臟與胸腺，稱量并計算其臟器指數。以上評價指標按照模型評價指標賦分標準進行評分，按權重計算出綜合得分。

3 結果

3.1 綜合評價指標體系綜合文獻調研和專家評分，按照AHP建立了評價目標樹(Fig 1)，通過計算獲得各指標權重(Tab 2)。

Tab 2 Evaluation index weight of guinea pigskininfection model of Trichophyton rubrum

3.2 體征變化各組豚鼠體質量均呈平穩(wěn)上升趨勢，體質量增長無明顯差異；免疫抑制劑處理前后與接菌前后，豚鼠進食量無明顯變化，活動狀況及精神狀態(tài)均正常。

3.3 外觀變化各組豚鼠約d 7結痂脫落，1組空白組毛發(fā)正常生長，無異常；其余實驗組約d 9開始出現紅斑和鱗屑，d 14左右病情發(fā)展到高峰；2組外觀癥狀輕，約d 21基本恢復正常；3、4組外觀癥狀稍重，約d 28基本恢復正常；5～7組外觀癥狀明顯，5組約d 40基本恢復正常，6、7組d 35基本恢復正常。病程初期紅斑較鱗屑早出現，鱗屑薄且透明、易脫落；隨后鱗屑逐漸變厚、變黃、難脫落；自愈過程中，紅斑逐漸褪去，鱗屑慢慢脫落，紅斑較鱗屑早褪去，皮膚逐漸變光滑，毛發(fā)受限生長區(qū)域縮小。見Fig 2。

3.4 病理學觀察如Fig 3所示，PAS染色顯微鏡下可觀察到菌絲和孢子被染成紫紅色，1組豚鼠皮膚實驗全過程均未見真菌侵染，2組實驗中期、3組各時期角質層可見少量菌絲，4～7組各時期角質層均可見大量菌絲，5～7組隨著病情發(fā)展真菌逐漸侵染到毛囊毛根部。

Fig 4的HE染色顯示，1組豚鼠皮膚實驗前期受到磨損，有少量炎癥細胞散在真皮淺層，其余各時期未見炎癥細胞聚集，2～7組各時期均有少量炎癥細胞散布在真皮淺層，3組后期角質層有少量炎癥細胞，4組中期表皮下層有大量炎癥細胞聚集，5、6、7組在角質層、結痂或鱗屑處有大量炎癥細胞聚集。

3.5 病原學檢查

3.5.1直接鏡檢 除空白組外，各實驗組d 4開始可在顯微鏡下明顯觀察到菌絲，毛發(fā)皮屑中菌絲數量隨時間逐漸減少，d 20開始菌絲不明顯，偶可觀察到散在的分生孢子。見Fig 5、Tab 3。

3.5.2逆培養(yǎng) Tab 3結果顯示，除空白組外，各實驗組接種7 d后培養(yǎng)基開始有菌落生長，且與接種菌株形態(tài)相同。5、6組陽性率最高，7組次之，2組陽性率最低。

Tab 3 Positive rate of hairs and scalemicroscopic examination and fungal culture(n=12)

Fig 1 Evaluation index system of skin infection animal model of Trichophyton rubrum

Fig 2 Changes in appearance of guinea pig skin

Fig3Skinsections(PAS staining×100) A～G: Group 1～7.The arrowheads refer to hyphae or spores.

Fig4Skinsections(HE staining×100) A～G:Group 1～7.

Fig 5 Microscopic examination in 10% KOH(×100)

A: Day 4; B: Day 14; C: Day 20; D: Day 26.The arrowhead refers to hyphae.

3.6 免疫學檢查

3.6.1免疫器官 與1組相比，4、5、6、7組豚鼠的脾臟和胸腺的臟器指數有所下降，但無統(tǒng)計學差異(Tab 4)。

GroupSpleen index(g/100g)Thymus index(g/100g)IgM/mg·L-110.180±0.0670.008±0.007268.90±22.6920.178±0.0530.008±0.007383.21±57.90*30.181±0.0610.008±0.006327.50±70.7940.169±0.0360.008±0.005246.82±73.50#50.157±0.0390.006±0.004284.32±53.32#60.166±0.0420.007±0.003303.65±65.9770.151±0.0400.007±0.004308.04±79.95

*P<0.05vsgroup 1;#P<0.05vsgroup 2

Fig 6 Comprehensive score chart of each group

3.6.2免疫功能 IgM出現在感染初期，豚鼠與紅色毛癬菌接觸后會產生免疫反應自身清除真菌[4,10]。Tab 4結果表明，與1組相比，其余各實驗組的血清IgM含量都有所升高，其中2組有差異有顯著性(P<0.05)；而與2組相比，4、5、6、7組IgM下降，尤以4、5組比較明顯(P<0.05)，提示長時間使用免疫抑制劑干預能明顯降低豚鼠感染后的自身清除能力。

3.7 模型綜合評價結合外觀病變、直接鏡檢、毛發(fā)皮屑逆培養(yǎng)和皮膚PAS染色陽性，模型構建成功確定。綜合各指標得出，2組模型成功率小于10%，3組成功率30%，4組58%，而5、6、7組均大于75%。取d 14的體征變化和外觀變化結合其他指標，按照模型評價指標賦分標準進行各項評分，按權重計算獲得各組綜合評分，按得分高低排序如下：5組>7組>6組>4組>3組>2組，見Tab 5,Fig 6。

4 討論

動物模型評價指標是一個多層次、多指標的系統(tǒng)，部分評價指標較難以定量。本研究通過實例證明，采用AHP構建的評價體系能較直觀地量化評價模型質量，從而更好地解決造模方法和評判標準不統(tǒng)一的問題，全面、科學、可靠地評價動物模型。紅色毛癬菌具有親人性，而不具有親動物性，因而，盡管其在流行病學調查中為導致皮膚癬菌感染中的優(yōu)勢菌種，但難以在動物上成模。動物皮膚磨損感染是文獻中常見的造模方法，本實驗模擬人體皮膚磨損后的真菌感染，同樣對豚鼠皮膚進行磨損接菌，觀察各組紅色毛癬菌感染發(fā)展的全過程。在設置考察因素時，我們結合文獻方法和自身的研究[4]，主要考察重復感染是否能提高模型成功率，因此，分別進行了接菌1 d與接菌2 d的造模研究；考察接受免疫抑制劑處理是否能促進紅色毛癬菌感染，以及如何使用免疫抑制劑，因此，比較了不接受免疫抑制劑處理、接受免疫抑制劑處理(曲安奈德、地塞米松聯用，或單用地塞米松)的差別。結果表明，正常情況下，不作任何免疫處理的豚鼠感染模型成功率極低，感染后皮膚外觀病征不明顯、自愈速度快、表皮內沒有孢子潛伏；而接受免疫抑制劑處理的豚鼠感染模型成功率大大提高，外觀病征明顯，外觀病征褪去后表皮內有孢子潛伏；于接菌前后單用地塞米松處理7 d的豚鼠病情發(fā)展和自愈速度相對較快，聯合兩種激素處理的豚鼠(由于接菌后隔天注射，前后共10 d)病情發(fā)展和自愈速度較平穩(wěn)，但二者之間差異不是很明顯；接菌2 d的豚鼠比接菌1 d的真菌(兩種方法的總接菌量一樣)感染率更高，模型質量更好。

豚鼠對紅色毛癬菌的自我清除能力強，難以自然感染，降低豚鼠自身的免疫力和重復接菌可增加易感性[10-11]。本研究中曲安奈德與地塞米松聯合處理+接菌2 d的模型(5組)綜合得分最高，可認為是實驗中篩選出的最佳紅色毛癬菌感染豚鼠模型。但為了提高模型的可操作性，我們簡化了處理方法，自行設計并研究了單用地塞米松處理的模型(7組)，該模型和5組比較接近；兩種模型的外觀病征都比較明顯[12]，孢子潛伏于表皮、毛囊內與臨床病程反復情況相似[13]，病情發(fā)展和自愈速度適合多數抗真菌藥物體內藥效評價的給藥療程[4,7,14]，有望推廣應用于抗真菌藥的藥效學評價。

Tab 5 Comprehensive score of each group

綜上所述，本研究采用AHP建立的評價指標體系清晰、簡便，優(yōu)選的紅色毛癬菌皮膚感染動物模型，為臨床真菌皮膚感染及新型抗真菌藥研究提供了基礎條件。