宮頸上皮非典型增生與陰道微生態(tài)的關(guān)系研究

徐忠淑,楊 剛,徐 敏

(重慶市武隆區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，重慶 408500)

宮頸癌是威脅全球婦女健康最為嚴(yán)重的疾病之一，是女性生殖道發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤。宮頸上皮非典型增生是一種癌前病變，從非典型增生發(fā)展至原位癌的一系列連續(xù)的癌前病變過程也稱為子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)[1]。陰道為開放性腔道，是人體內(nèi)重要微生態(tài)區(qū)，正常情況下是以乳桿菌等優(yōu)勢(shì)菌為主組成的微生態(tài)系統(tǒng)，陰道微生態(tài)是一個(gè)非常靈敏的系統(tǒng)，在受到內(nèi)源性和外源性因素影響時(shí)，很容易發(fā)生改變，繼而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究已證實(shí)人乳頭狀病毒(HPV)持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸上皮非典型增生的重要原因，也有研究指出陰道微生態(tài)失衡后可導(dǎo)致生殖系統(tǒng)炎癥及外陰發(fā)生上皮內(nèi)非瘤樣病變[2]，陰道細(xì)菌性疾病與CIN的發(fā)生具有密切關(guān)系[3]。HPV感染、宮頸上皮非典型增生與陰道微生態(tài)變化之間的關(guān)系尚不明確。因此，本研究對(duì)宮頸上皮非典型增生患者的陰道微生態(tài)情況進(jìn)行分析，旨在揭示這兩者之間可能存在的關(guān)系，從而為宮頸癌的早期防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 對(duì)2017年1-12月在本院體檢的234例已婚女性采用宮頸脫落細(xì)胞學(xué)(TCT)檢查，采集標(biāo)本進(jìn)行HPV-DNA 分型檢測(cè)，并在陰道鏡下采集宮頸組織進(jìn)行病理學(xué)診斷。根據(jù)細(xì)胞學(xué)和病理診斷結(jié)果，將細(xì)胞學(xué)診斷為無明確診斷意義的鱗狀細(xì)胞病變(ASCUS)但病理結(jié)果正常者作為對(duì)照組，CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組為實(shí)驗(yàn)組。其中，對(duì)照組91例，平均年齡(35.8±13.5)歲；CINⅠ組78例，平均年齡(37.2±13.7)歲；CINⅡ/Ⅲ組65例，平均年齡(36.3±15.1)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～65歲，無宮頸錐切病史、檢查前3 d未同房、近1個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行陰道相關(guān)疾病治療、對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：宮頸腺細(xì)胞異常者、ASCUS及以上病變嚴(yán)重程度者、妊娠期或哺乳期、生殖器官其他感染性疾病患者、免疫功能低下或免疫性疾病患者、惡性腫瘤患者、合并其他嚴(yán)重臟器疾病患者。

1.2方法 常規(guī)方法采集患者的陰道分泌物，進(jìn)行陰道微生態(tài)檢測(cè)，具體包括：(1)采用涂片革蘭染色法，在顯微鏡下檢查陰道分泌物中的滴蟲、念珠菌、線索細(xì)胞等微生物情況；(2)用pH精密試紙測(cè)定陰道pH;(3)愛必維試劑盒檢測(cè)患者的陰道微生物功能情況，首先將試劑盒復(fù)溫至室溫，取出反應(yīng)裝置并在反應(yīng)裝置的5個(gè)孔中各滴加一滴經(jīng)處理過的陰道分泌物樣品，在“唾液酸苷酶”反應(yīng)孔中滴加一滴“顯色液A”，置于37 ℃水浴10 min，在“凝固酶”反應(yīng)孔中滴加一滴“顯色液B”，繼續(xù)37 ℃水浴3 min后判讀結(jié)果，具體檢測(cè)方法及結(jié)果判讀參照試劑盒的說明書。用生理鹽水沖洗宮頸及陰道上1/3，回收沖洗液并2 000 r/min離心10 min，收集上清。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)陰道灌洗液中細(xì)胞因子水平情況，具體包括人樹突狀細(xì)胞趨化因子(CCL22)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素10(IL-10)3種細(xì)胞因子。常規(guī)方法采集宮頸口分泌物標(biāo)本，采用亞能生物HPV(23 型)分型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行HPV分型檢測(cè)，該試劑盒采用PCR體外擴(kuò)增和DNA反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)，主要步驟有HPV DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交、洗膜、顯色等，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，顯色后進(jìn)行結(jié)果判定。在陰道鏡下采集病變明顯部位的宮頸組織，由病理科進(jìn)行病理診斷。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；多因素分析采用多分類logistic回歸分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1陰道分泌物檢測(cè)陰道微生態(tài)情況 陰道微生態(tài)正常者43例，占18.38%(43/234)；陰道微生態(tài)異常者191例，占81.62%(191/234)。CINⅠ組和CINⅡ/Ⅲ組的陰道pH值均顯著高于對(duì)照組，CINⅡ/Ⅲ組高于CINⅠ組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組研究對(duì)象的微生物菌群檢測(cè)結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2陰道灌洗液細(xì)胞因子表達(dá)情況 隨著宮頸上皮非典型增生程度加重，陰道灌洗液中的IL-10水平逐漸降低，其中CINⅡ/Ⅲ組顯著低于CINⅠ組和對(duì)照組，CINⅠ組低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另兩種細(xì)胞因子水平在不同組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組研究對(duì)象的陰道微生態(tài)檢測(cè)情況比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CINⅠ組比較，△P<0.05

表2 3組研究對(duì)象陰道灌洗液細(xì)胞因子表達(dá)情況比較 (pg/mL)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CINⅠ組比較，△P<0.05

表3 3組研究對(duì)象宮頸脫落細(xì)胞中HPV感染情況比較[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與CIN Ⅰ組比較，△P<0.05

2.3宮頸脫落細(xì)胞中HPV感染情況 隨著宮頸上皮非典型增生程度加重，HPV陽(yáng)性率逐漸升高，其中CINⅡ/Ⅲ組均高于對(duì)照組和CINⅠ組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4宮頸上皮非典型增生的危險(xiǎn)因素分析 將病變程度作為因變量，上述分析得出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量，進(jìn)行多因素logistic回歸分析。變量設(shè)為X1、X2、X3，因素分別為HPV感染(陽(yáng)性=1；陰性=2)、陰道pH值(pH≤4.5=1；pH>4.5=2)、IL-10表達(dá)(IL-10≤400 pg/mL=1；IL-10>400 pg/mL=2)、病變程度(對(duì)照組=0；CINⅠ=2；CINⅡ/Ⅲ=3)。結(jié)果顯示：陰道pH值升高、IL-10表達(dá)降低及HPV陽(yáng)性均是宮頸上皮發(fā)生非典型增生的危險(xiǎn)因素。宮頸上皮非典型增生影響因素logistic分析見表4。

表4 宮頸上皮非典型增生影響因素logistic分析

注：-表示無數(shù)據(jù)

3 討 論

陰道在解剖上是半開放通道結(jié)構(gòu)，有多種微生物生存，形成局部的微生態(tài)系統(tǒng)，且通常情況下陰道具有維持微生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡的能力，取決于機(jī)體的內(nèi)分泌功能情況及陰道的局部免疫狀況[6]。菌群生態(tài)平衡的任何改變對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展影響甚大，當(dāng)因某些原因?qū)е玛幍牢⑸鷳B(tài)平衡被打破時(shí)，部分微生物菌群可能大量繁殖，從而導(dǎo)致陰道及宮頸發(fā)生各種疾病，常見有泌尿生殖道炎癥、外陰上皮內(nèi)出現(xiàn)非瘤樣病變等[7-8]。近年來的一系列研究已經(jīng)證實(shí)持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)是發(fā)生宮頸肉瘤樣病變及宮頸癌的最重要的危險(xiǎn)因素，本研究分析結(jié)果也顯示HPV陽(yáng)性是宮頸上皮非典型增生的危險(xiǎn)因素，且HPV感染陽(yáng)性率越高，病變程度越重。究其原因，pH值是維持陰道微生態(tài)平衡的重要因素，健康女性的陰道pH值介于3.8～4.5，弱酸性環(huán)境的維持得益于陰道內(nèi)乳酸桿菌及機(jī)體雌激素維持動(dòng)態(tài)平衡，一方面有助于抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)乳酸桿菌還通過調(diào)節(jié)其自身生長(zhǎng)情況來阻止外環(huán)境中致病菌的侵入[9-10]。有研究指出，當(dāng)陰道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量減少、陰道菌群失調(diào)或免疫功能受到抑制時(shí)，pH值可出現(xiàn)升高[11]。本研究分析結(jié)果顯示，CINⅠ組和CINⅡ/Ⅲ組的陰道pH值均顯著高于對(duì)照組，且CINⅡ/Ⅲ組高于CINⅠ組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，多因素分析結(jié)果顯示陰道pH值升高是宮頸上皮非典型增生的危險(xiǎn)因素?？紤]到pH 值升高，陰道內(nèi)乳酸桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，菌群平衡被打破，進(jìn)而可導(dǎo)致患者出現(xiàn)HPV持續(xù)感染；而HPV感染又進(jìn)一步加劇陰道菌群失衡，使局部的免疫微環(huán)境形成的生物屏障遭到破壞，進(jìn)而使宮頸局部的免疫功能出現(xiàn)異常，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致宮頸病變[12-13]。pH值作為陰道微生態(tài)平衡狀況的一項(xiàng)重要指示指標(biāo)，與陰道微生物菌群的生長(zhǎng)情況密切相關(guān)[14]，因而當(dāng)陰道pH值變化時(shí)往往提示微生態(tài)平衡可能被打破，而微生態(tài)失衡是宮頸發(fā)生病變的重要危險(xiǎn)因素。尋找各種體液生物標(biāo)志物是腫瘤診斷或早期發(fā)現(xiàn)的重要技術(shù)手段，陰道灌洗液可被視作為最接近體液的一種局部體液，而局部微環(huán)境免疫狀態(tài)的變化在局部體液中的各生物標(biāo)志物的表現(xiàn)比在血液中的變化更為敏感，也更具特異性。既往一些研究指出宮頸發(fā)生CIN或HPV感染時(shí)，在患者的局部組織或血液中可出現(xiàn)IL-2、IL-10及CCL22等炎癥指標(biāo)的變化[15-16]，但在陰道灌洗液中的變化情況，國(guó)內(nèi)外仍罕見相關(guān)報(bào)道，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步探討具有重要意義。另一方面，IL-10等細(xì)胞因子作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在陰道內(nèi)的局部免疫功能中發(fā)揮著重要作用[17]。IL-10具有雙向調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能，一方面可通過抗炎作用對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起到抗腫瘤作用，另一方面又可通過負(fù)向免疫調(diào)節(jié)途徑起到促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用[18]。本研究結(jié)果顯示，宮頸上皮非典型增生者(CINⅡ/Ⅲ組和CINⅠ組)陰道灌洗液的IL-10水平低于對(duì)照組，且CINⅡ/Ⅲ組低于CINⅠ組，多因素分析結(jié)果顯示IL-10降低是宮頸上皮非典型增生的危險(xiǎn)因素。提示IL-10 減低可以促進(jìn)宮頸上皮非典型增生的發(fā)生。但也有研究發(fā)現(xiàn)在一些CINⅢ患者中可出現(xiàn)IL-10升高現(xiàn)象，而持續(xù)的 HPV 感染可能激發(fā) IL-10 干擾正常的免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致宮頸癌[19-21]。因此，可以認(rèn)為陰道IL-10水平的異常變化對(duì)宮頸病變具有重要的提示作用，IL-10 水平降低與宮頸癌前病變的發(fā)生有關(guān)，其變化或可作為宮頸病變的預(yù)測(cè)因子，值得深入研究。至于在本組研究中未觀察到IL-2和CCL22有明顯變化，提示這兩種細(xì)胞因子可能在宮頸上皮非典型增生期無明顯變化，這與曹建芳[18]研究報(bào)道的結(jié)果基本一致。至于陰道細(xì)菌性疾病與宮頸上皮非典型增生之間的關(guān)系，目前研究結(jié)果尚存在較大的爭(zhēng)議。HPV持續(xù)感染可破壞陰道局部免疫微環(huán)境生物屏障已得到諸多研究報(bào)道證實(shí)[19]。但本研究發(fā)現(xiàn)不同組別研究對(duì)象的微生物菌群檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能是研究對(duì)象較少或檢測(cè)方法差異造成的，且本研究未比較HPV感染與未感染者在微生物菌群上的差異情況，這需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，陰道微生態(tài)變化對(duì)宮頸上皮非典型增生具有重要影響，HPV感染、陰道pH值升高及細(xì)胞因子IL-10的降低是宮頸上皮非典型增生的危險(xiǎn)因素。