周旭峰 李江華 張愛華 魏曉麗 范宗憲 王桂梅 孫海燕

腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages,TAM）是血液循環(huán)中的單核細胞受腫瘤微環(huán)境中細胞因子和趨化因子作用，進人腫瘤微環(huán)境后分化而成的成熟巨噬細胞，是浸潤在腫瘤組織周圍最多的免疫細胞，它可以分泌多種細胞因子，促進腫瘤的侵襲和轉移[1，2]。本研究采用免疫組化方法檢測TAM及微淋巴管在喉咽癌組織的表達情況，從而探討TAM浸潤在喉咽癌侵襲和發(fā)展中的作用及其與腫瘤預后的關系。

資料與方法

1 一般資料

隨機抽取2004年1月～2013年12月間，在佳木斯大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科接受手術的喉咽癌52例。其中男47例，女5例，年齡43～79歲，平均57歲。所有病例術前未行放化療，標本經病理確診，其中T1期4例、T2期15例、T3期10例、T4期23 例；高、中、低分化病例分別為 9、30、13 例；其中淋巴結轉移者 21 例（N1、N2、N3分別為 7、13、1 例），無淋巴結轉移31例；有遠處轉移9例。

2 主要免疫試劑及方法

DAB顯色試劑盒、PV-6000免疫組化試劑盒、CD68兔抗人單克隆抗體等主要試劑購自福建邁新生物科技公司。標本石蠟包埋，做4um連續(xù)切片，免疫組化操作程序嚴格按照說明書執(zhí)行，以PBS液代替一抗做陰性對照。

3 計數(shù)方法

CD68陽性表達位于巨噬細胞胞漿，呈黃褐色顆粒。每張免疫組化切片分別選取癌內及癌周不同組織CD68+TAM最為密集的5個視野，在400倍顯微鏡下進行CD68+TAM計數(shù)，根據CD68+TAM的中位數(shù)將標本分為高表達組和低表達組[3]。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據分析，行方差齊性檢驗、t檢驗、χ2檢驗和Spearman相關分析，應用Kaplan-Meier進行生存分析和Log-rank法檢驗組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 喉咽癌組織CD68+TAM表達

喉咽癌組織CD68+TAM主要分布于癌內及癌周間質，呈片狀分布，胞體較大，形狀不規(guī)則。52例喉咽癌標本中37例（71.51%）癌內存在CD68+TAM浸潤，41例癌周存在CD68+TAM浸潤，差異無統(tǒng)計學意義，癌內CD68+TAMs數(shù)目為0至331之間(中位數(shù)為11.5個)，癌周間質CD68+TAM數(shù)目從0至347個（中位數(shù)為20.5個）。

癌旁正常組織CD68+TAM呈散在分布，數(shù)目從0至7個(中位數(shù)為2.5個)。

2 癌內及癌周間質與癌旁正常組織CD68+TAM比較

癌內與癌旁正常組織CD68+TAM計數(shù)有明顯差異（t=19.63，P<0.01），癌周間質與癌旁正常組織CD68+TAM 計數(shù)有明顯差異（t=20.17，P<0.01），癌內及癌周間質CD68+TAM計數(shù)無明顯差異（t=2.19，P＞0.05）。

3 癌內及癌周CD68+TAM計數(shù)與患者生存時間的關系

隨著喉咽癌組織癌內CD68+TAM計數(shù)上升，患者生存時間變短，二者之間呈負相關，（r=-0.257，P<0.05）；同樣隨著癌周間質CD68+TAM計數(shù)上升，患者生存時間變短，二者亦呈負相關（r=-0.269，P<0.05)。

4 癌內及癌周間質CD68+TAM浸潤與喉咽癌臨床指標的關系

癌內及癌周間質CD68+TAM浸潤與臨床指標的關系見表1。喉咽癌癌內TAM計數(shù)隨腫瘤T分期上升而增加，并與腫瘤不良預后密切相關（P<0.05），而癌周間質TAM計數(shù)與淋巴結轉移密切相關（P<0.05）。

表1 癌內及癌周CD68+TAM與喉咽癌臨床指標的關系

5 CD68+TAM計數(shù)與喉咽癌預后的關系

本組52例病例5年內死亡32例，均為腫瘤原因死亡，總體5年生存率為38.4%。根據CD68+TAM的中位數(shù)將病例分為癌內高CD68+TAM組和低CD68+TAM組，癌周高CD68+TAM組和低CD68+TAM組，并繪制生存率曲線圖。經Log-rank檢驗組

圖1 癌內高TAM組與低TAM組的生存曲線

討論

腫瘤相關巨噬細胞(TAM)來源于血液循環(huán)中的單核細胞，主要分為兩種亞型，即M1型（經典激活的TAM）和M2型（選擇性激活的TAM）。血液中的單核細胞受腫瘤和腫瘤間質中細胞因子和趨化因子（CCL4,CCL5,CCL7,CCL8,CXCLI2,M-CSF,VEGF,PDGF等)的作用，被募集到腫瘤周圍，在各種細胞因子（如MCP-1，M-CSF,VEGF等）的刺激下，分化成為不同亞型的TAM[2]。輔助性1型T細胞因子IFN-γ，脂多糖（LPS），集落刺激因子（GM-CSF）等促使TAM向M1型極化；輔助性1型T細胞分泌和腫瘤來源的細胞因子：TGF-β、PGE2、IL-4、IL-13 等促使TAM向M2型極化[4]。在腫瘤微環(huán)境中M1型和M2型TAM可相互極化，Herwig[5]等研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ可誘導M1型TAM向M2型極化，M2型TAM比例的增高提示腫瘤細胞增殖及預后不良。現(xiàn)有研究表明，TAM與肺癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤患者不良預后密切相關[6，7]。本研究中，喉咽癌癌內TAM浸潤密度隨著腫瘤T分期上升而增加，并且TAM浸潤密度越高，患者預后越差，表明TAM浸潤可促進喉咽癌發(fā)展，與其預后呈負相關。

圖2 癌周高TAM組與低TAM組的生存曲線

TAM參與并促進腫瘤組織血管和淋巴管的生成。TAM能分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）、尿激酶型纖溶酶原激活因子（uPA），MMPs和uPA可直接激活腫瘤血管內皮細胞的增生，促進它們在腫瘤細胞間差異，癌內高CD68+TAM組5年生存率為18.7%，癌內低CD68+TAM組5年生存率為49.3%，二者差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見圖1）；癌周間質高CD68+TAM組5年生存率為19.3%，癌周間質低CD68+TAM組5年生存率為51.7%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見圖 2）。外基質中遷移，形成新的腫瘤血管[8]。Depalma等[9]研究表明，TAM通過ANG2/TIE2信號通路調節(jié)血管內皮細胞生物學性能，破壞原有血管以促進血管生成。Riahov等[10]臨床研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、胃癌、乳腺癌、B細胞非Hodgkin淋巴瘤、膠質瘤等多種惡性腫瘤中，TAM數(shù)量與腫瘤血管的密度等級呈正相關。Jeon等[11]通過對卵巢癌小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，TAM通過上調腫瘤組織中VEGF-C和VEGF-D表達來激活淋巴管特異性受體-血管內皮生長因子受體3(VEGFR-3)，促進淋巴管生成。Kurahara等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TAM能誘導腫瘤細胞分泌VEGF-C促進腫瘤的淋巴結轉移和浸潤，同時促進腫瘤淋巴管的形成。在宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌組織中，TAM上調VECF-C表達，促進腫瘤淋巴管的形成，促進腫瘤細胞淋巴管轉移[13，14]。本研究中，喉咽癌癌周間質TAM浸潤與淋巴結轉移密切相關，因此推測TAM可能通過促進喉咽癌組織微淋巴管的生成而促使腫瘤通過淋巴管轉移，這與前述研究結果相符。

本研究表明，喉咽癌癌內及癌周高TAM浸潤組患者5年生存率明顯低于癌內及癌周低TAM組，可以推測TAM浸潤是影響喉咽癌患者預后的主要因素之一，我們可以通過檢測喉咽癌組織TAM浸潤情況，判斷喉咽癌患者的預后，為其臨床治療提供參考。