王繼英，成建國，林 松，王彥平，趙雪艷，武 英，朱曉東，謝晉堂，方美英

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實驗室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東春藤食品有限公司棗莊黑蓋豬原種豬場，山東 棗莊 277100；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193）

畜禽系譜記錄的準(zhǔn)確性對控制畜禽近交系數(shù)增加、遺傳改良至關(guān)重要。由于未知血緣個體的引進(jìn)、記錄過程中的人為失誤等原因，系譜記錄錯誤在畜禽生產(chǎn)、育種和保種過程中普遍存在。奶牛的系譜研究最多。Banos 等[1]研究表明國外奶牛系譜平均錯誤率約為11%，初芹等[2]評估了我國荷斯坦牛群體的系譜，發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦牛群平均系譜錯誤率為16.62%。除奶牛外，系譜錯誤在其他畜種中也有研究報道。2014 年，張哲等[3]對某個杜洛克豬群體進(jìn)行系譜分析，發(fā)現(xiàn)其系譜的錯誤率為6%。

錯誤的系譜信息會導(dǎo)致遺傳評定準(zhǔn)確性大大降低，減慢群體的遺傳進(jìn)展，比系譜缺失帶來更大的育種損失[4]。同時，錯誤的系譜信息也會影響基因定位和基因組選擇等其他利用系譜信息的研究可靠性。對地方畜禽保種群體而言，保種豬來源主要從不同個體養(yǎng)豬從業(yè)者搜集而來，難以得到準(zhǔn)確的個體親緣信息。另外，很多地方品種的系譜記錄不完全、系譜信息錯誤多，甚至無系譜。不完整或錯誤的系譜信息會使群體近交系數(shù)過快增加，從而加速群體近交退化導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

近年來，單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP）作為新一代分子標(biāo)記，具有基因組覆蓋度高、分布范圍廣、分型準(zhǔn)確性高和成本低等特點(diǎn)，逐漸成為人類及動植物親緣關(guān)系鑒定及遺傳研究中最常用的分子標(biāo)記。隨著測序及生物芯片技術(shù)的進(jìn)步，目前已有多種豬的商業(yè)化SNP 芯片陸續(xù)推出，使得從全基因組層面上研究地方豬種的遺傳結(jié)構(gòu)和系譜特征成為可能。

棗莊黑蓋豬，俗稱“蓋子豬”，是在獨(dú)特的地理氣候條件、自然資源及人文環(huán)境下形成的地方豬遺傳資源。從20 世紀(jì)80 年代開始，隨著外來品種的引進(jìn)，棗莊黑蓋豬不斷地被淘汰，養(yǎng)殖數(shù)量越來越少，一度處于瀕危的邊緣。2004年，在山東省畜牧獸醫(yī)局、滕州市畜牧獸醫(yī)局、山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)支持下，山東春藤食品有限公司對棗莊黑蓋豬這一古老豬種資源進(jìn)行保護(hù)性地發(fā)掘、繁育、提純和復(fù)壯。2019 年3 月，棗莊黑蓋豬通過國家畜禽遺傳資源委員會遺傳資源鑒定。本研究利用全基因組范圍內(nèi)高密度的SNP 標(biāo)記，對棗莊黑蓋豬核心群樣本進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析并構(gòu)建家系，為該豬種的保護(hù)利用提供了分子水平的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點(diǎn)

試驗于2018 年10 月在棗莊黑蓋豬場采集樣本，2018 年11 月份委托北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行SNP 基因型測定。2018 年底在山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實驗室進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2 試驗材料

棗莊黑蓋豬核心群200 頭公、母豬，用耳號鉗剪取少許耳組織放入離心管中，加入75%酒精浸泡，-20 ℃保存以備基因組DNA 提取。

1.3 基因型測定

利用血液/ 組織/ 細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取待測樣本基因組DNA，經(jīng)Nanodrop（260/280在1.7 ～2.1 范圍之間，濃度＞50 ng/ul）和瓊脂糖凝膠電泳（條帶清晰）檢測合格后，委托北京康普森生物技術(shù)有限公司利用Illumina CAUPorcineSNP50 BeadChip 芯片進(jìn)行基因組SNP 測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 SNP 質(zhì)量控制

利 用PLINK v1.90[5]按 照 以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)控：1）去除檢出率小于0.95 的SNP 標(biāo)記（命令：plink--file myfile--geno 0.05）；2）去除最小等位基因頻率（Minor allele frequency, MAF）小于0.05（命令：plink--file myfile--maf 0.05） 的SNP 標(biāo)記。質(zhì)量控制后剩余SNP 用于后續(xù)分析。

1.4.2 群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

基于質(zhì)控后的SNP 數(shù)據(jù)，利用PLINK v1.90[5]進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）（ 命 令：plink--file myfile --pca 4），并利用R 軟件繪制第一主成分與第二主成分的二維圖?；诨蚪M同源相同（Identity-by-descent，IBD）信息，利用PLINK v1.90[5]（命令plink--file myfile--genome）評估棗莊黑蓋豬群體個體對間親緣系數(shù)及家系內(nèi)個體對親緣系數(shù)。

1.4.3 群體系統(tǒng)發(fā)生樹分析和分子系譜劃分

利用MEGA7 軟件[6]，采用鄰接法（Neighbour joining, NJ）繪制棗莊黑蓋豬核心群樣本的分子系統(tǒng)發(fā)生樹。基于系統(tǒng)發(fā)生樹，劃分各個家系，構(gòu)建分子系譜。

1.4.4 群體和家系的遺傳多樣性分析

利用PLINK v1.90[5]對棗莊黑蓋豬整個群體和各個家系進(jìn)行觀察雜合度（Observed heterozygosity, HO）和期望雜合度（Expected heterozygosity, HE）（ 命 令：plink--file myfile--hardy）等遺傳多樣性指標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP 質(zhì)量控制

研究采用Illumina CAUPorcin eSNP55 BeadChip 芯片，對棗莊黑蓋豬基因組SNP 進(jìn)行掃描分型，共檢測出43 832 個SNP 位點(diǎn)。其中39 140 個SNP 通過質(zhì)量控制可用于后續(xù)分析。質(zhì)控后每條染色體的SNP 數(shù)目及SNP 間隔距離如圖1所示?？梢钥闯觯煌旧wSNP間隔距離分布較為均衡，平均為66.23 kb。由于染色體長度差異，不同染色體SNP 數(shù)量變化較大，1 號染色體SNP 數(shù)目最多為4 646 個，18號染色體SNP數(shù)目最少為996個。

2.2 種群親緣關(guān)系分析

首先利用質(zhì)控后SNP 數(shù)據(jù)，對200 個樣本進(jìn)行主成分分析，初步了解棗莊黑蓋豬群體遺傳結(jié)構(gòu)。圖2 為根據(jù)主成分1 和主成分2 繪制的散點(diǎn)圖?？梢钥闯觯瑮椙f黑蓋豬樣本在圖中的分布很不均勻，其中第2 主成分中左側(cè)的個體比較緊密，表明這些棗莊黑蓋豬的親緣關(guān)系較近。

利用基因組IBD 信息進(jìn)一步評估棗莊黑蓋豬樣本全部個體對的親緣系數(shù)。200 個樣本可以形成19 900 個關(guān)系對，其平均親緣系數(shù)為0.103 2。其中，85.84% 個體對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（親緣系數(shù)≤0.25），13.30%個體對親緣關(guān)系較近（親緣系數(shù)0.25 ～0.5），另有0.86%個體對親緣關(guān)系很近（親緣系數(shù)≥0.5），這些個體對之間交配極有可能使隱性不良基因純合造成近交衰退。故對于這部分親緣系數(shù)較大或很大的個體對，選配時需要格外注意避開。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及家系構(gòu)建

為研究棗莊黑蓋豬樣本的家系組成，基于芯片數(shù)據(jù)對棗莊黑蓋豬進(jìn)行群體分子系統(tǒng)發(fā)生樹分析。圖3 為采用NJ 法繪制的系統(tǒng)發(fā)生樹，可以看出，棗莊黑蓋豬在分子系統(tǒng)發(fā)生樹上聚集成幾個獨(dú)立的大分支，這些分支可以作為家系劃分的依據(jù)。另外，還有一些小分支，數(shù)量多，每個支內(nèi)的樣本數(shù)少，不作為單獨(dú)家系劃分。綜合考慮系統(tǒng)發(fā)生樹的分支和公豬分布，把棗莊黑蓋豬分成了8 個家系，分別用紅色、藍(lán)色、淺綠色、黃色、紫色、灰色、黑色和墨綠色表示。

圖1 質(zhì)量控制后SNP 在各染色體上的數(shù)量及間隔距離

圖2 棗莊黑蓋豬種群的主成分分析結(jié)果

各家系樣本量、遺傳多樣性、親緣系數(shù)信息詳見表1。家系樣本量變化較大，家系3 樣本量最大為38 個，家系1 樣本量最小為18。由于家系劃分時考慮了公豬的分布，公豬分配較均勻，有利于后期配種計劃的制定。不同家系的遺傳多樣性變化較小，最大為0.358 5，最小為0.253 7。不同家系內(nèi)個體對親緣系數(shù)變化較大，其中，家系4 的親緣系數(shù)最高（0.340 7），其次為家系1（0.323 6），這與兩個家系樣本量小，在系統(tǒng)發(fā)生樹上聚集最為緊湊相一致；家系6 的親緣系數(shù)最?。?.140 0），這與該家系由4 個相對獨(dú)立分支組成有關(guān)。家系內(nèi)個體對親緣系數(shù)均明顯大于整個群體的個體對親緣系數(shù)（0.103 2），故為避免群體近交系數(shù)過快增長，制定配種計劃時，應(yīng)家系間個體交配，盡量避免同一家系內(nèi)個體之間的交配。

3 結(jié)論

本研究利用基因組上39 140 個SNP 標(biāo)記，對棗莊黑蓋豬核心群進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)、親緣系數(shù)、系統(tǒng)發(fā)生樹等遺傳分析及分子系譜構(gòu)建，結(jié)果表明棗莊黑蓋豬的親緣關(guān)系分布很不均勻，部分個體對親緣系數(shù)大，親緣關(guān)系較近，在選配過程中，如不能避開這些個體之間的交配可能造成近交現(xiàn)象。棗莊黑蓋豬在分子系統(tǒng)發(fā)生樹上聚集成幾個獨(dú)立的分支，綜合考慮系統(tǒng)發(fā)生樹的分支和公豬分布，把棗莊黑蓋豬分成了8 個家系，不同家系內(nèi)個體對親緣系數(shù)變化較大，但均明顯大于群體的個體對親緣系數(shù)。為避免群體近交系數(shù)過快增長，棗莊黑蓋豬選配時，應(yīng)盡量避免同一家系內(nèi)個體之間的交配。

表1 棗莊黑蓋豬各家系遺傳多樣性、親緣系數(shù)信息

圖3 基于基因組SNP 構(gòu)建的棗莊黑蓋豬NJ 系統(tǒng)發(fā)生樹