陳秋燃，李佳麗，劉 明，周 娟，陳 陽(yáng)，吳信生

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

被毛顏色是獺兔重要的經(jīng)濟(jì)特征之一，早期的遺傳學(xué)研究在孟德?tīng)柗▌t的重新發(fā)現(xiàn)不久后就已經(jīng)開(kāi)始毛色相關(guān)研究了[1-3]。分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)酪氨酸酶（TYR）、黑皮質(zhì)素 1 受體（MC1R）、黑素蛋白（MLPH）基因的突變會(huì)導(dǎo)致毛色變化的現(xiàn)象[4-7]，它們都通過(guò)參與生物合成活性或者調(diào)節(jié)有關(guān)黑色素生成細(xì)胞的分布過(guò)程等來(lái)調(diào)控毛色[3-4]。MC1R 是控制毛色的重要候選基因之一，參與毛色的形成，在小鼠上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MC1R 與毛色有一定的聯(lián)系[8]。MC1R 基因也對(duì)黑色素形成的造成影響，連鎖控制黑色素形成的主要基因。該基因被發(fā)現(xiàn)可以參與調(diào)控斑馬魚(yú)的金色表型，致使皮膚黑色素細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞黑色素小體體積與數(shù)量發(fā)生改變[9]。此外，利用 siRNA 干擾雞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞SLC24A5，發(fā)現(xiàn)色素細(xì)胞合成黑色素的能力受到抑制，影響黑色素的沉積[10]。Slc7a11 基因是新發(fā)現(xiàn)的功能新基因位于染色體4q28q32，是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)第7家族的第11 位成員，共12 個(gè)外顯子[11]。它是毛發(fā)中偽黑素和真黑素主要的調(diào)控基因，能夠直接控制偽黑素的產(chǎn)生。該基因編碼的氨基酸負(fù)責(zé)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)胱氨酸和谷氨酸，當(dāng)Slc7a11 基因發(fā)生大片段缺失后，導(dǎo)致其編碼的蛋白改變，使氨基酸失去功能，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法還原成半胱氨酸，從而不能滿足細(xì)胞中合成褐黑素的需要，最終導(dǎo)致毛色表現(xiàn)為真黑色素的黑顏色，從而缺乏由褐黑素產(chǎn)生的黃色[12-14]。我們也嘗試在不同毛色的獺兔中尋找該區(qū)域的類(lèi)似缺失，但是并無(wú)所獲。因此，本研究擬在Slc7a11 的外顯子區(qū)域掃描SNPs，隨后通過(guò)構(gòu)建Slc7a11 基因過(guò)表達(dá)載體檢測(cè)其對(duì)黑色素生成相關(guān)基因的影響，進(jìn)一步探究Slc7a11 基因?qū)ΛH兔的毛色形成機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選擇同批次出生的健康的獺兔163 只（包括白色37 只、青紫藍(lán)色72 只、黑色20 只、黃色34只）均來(lái)自浙江省余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司。每只獺兔采集耳部組織放入裝有2 mL 70%乙醇溶液的離心管中，置于冰盒中保存，用于DNA 提取。同時(shí)，采集黑色獺兔背部皮膚組織，置于-80 ℃凍存，用于RNA 提取。

1.1.2 試驗(yàn)材料

限制性內(nèi)切酶HindⅢ和SacⅡ來(lái)自TaKaRa 公司；血液基因組DNA 提取試劑盒、DNA 純化試劑盒、RNA 提取試劑盒、FastQuant RT Kit、質(zhì)粒小提質(zhì)試劑盒均購(gòu)自天根公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)NCBI 獲取兔Slc7a11 基因DNA 序列（登錄號(hào) NC_013683.1）和 mRNA 序列（登錄號(hào) XM_008 267436），運(yùn)用 Primer5.0、Oligo6.0 軟件設(shè)計(jì)外顯子區(qū)（表1）和CDS 區(qū)的特異性引物（表2），以及MC1R、SLC24A5 熒光定量引物，由北京擎科新業(yè)有限公司合成。

1.3 獺兔Slc7a11基因DNA外顯子多態(tài)性檢測(cè)

首先利用天根DNA 提取試劑盒提取獺兔耳組織DNA，使用NanoDrop 2000 核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)DNA 濃度和 OD 值，OD 值為 1.8～2.0 的樣品可用，后用TE 將樣品稀釋至相同濃度。反應(yīng)體系：反應(yīng)總體系20 μL，其中 2×Taq PCR Master Mix 10 μL、ddH2O 7 μL、上下游引物各 1 μL、DNA 模板 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；最適退火溫度30 s；72 ℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸 10 min。

PCR 產(chǎn)物檢測(cè)：對(duì)擴(kuò)增后的PCR 原液用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照存檔。

1.4 Slc7a11蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析方法

運(yùn)用軟件SeqMan 和MegAlign 將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，尋找SNP 位點(diǎn)并利用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析Slc7a11 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能（表3）。

1.5 Slc7a11基因克隆和真核表達(dá)載體構(gòu)建

Slc7a11 基因PCR 產(chǎn)物切膠回收后與pEGFPN1 載體進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆提取后用HindⅢ和SacⅡ雙酶切鑒定。pEGFP-N1 載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.6 轉(zhuǎn)染

所用細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存的RAB-9 細(xì)胞（購(gòu)于ATCC），將細(xì)胞從液氮中取出立即放入37 ℃水浴中快速解凍并接種于M254 培養(yǎng)基中加入10%血清。

試驗(yàn)設(shè)置空白組、陰性對(duì)照組、試驗(yàn)組，將RAB-9 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24 孔板的培養(yǎng)板上，每孔至少接種1×105個(gè)，在黑色素細(xì)胞狀態(tài)良好覆蓋率約80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況和RT-PCR 檢測(cè)mRNA 水平。陰性對(duì)照組為轉(zhuǎn)染的空質(zhì)粒，過(guò)表達(dá)組為轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Slc7a11。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用2-△△Ct相對(duì)定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算公式：△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct待測(cè)樣品中的對(duì)照基因-△Ct對(duì)照樣品中的目的基因；相對(duì)樣品模板量=2-△△Ct。所有定量數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。

表1 Slc7a11 外顯子和CDS 區(qū)引物序列Table 1 Primer sequence of Slc7a11 exons and CDS region

表2 熒光定量引物Table 2 qPCR primer sequence

表3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)方法及相關(guān)網(wǎng)址Table 3 Protein structure function prediction method and related web site

2 結(jié)果與分析

2.1 兔Slc7a11基因序列的分析

本研究測(cè)定家兔Slc7a11 基因全長(zhǎng)序列，包含完整的CDS 區(qū)序列1 509 bp，編碼502 個(gè)氨基酸，12 個(gè)外顯子，11 個(gè)內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)如圖1 所示。A、T、C、G 的平均含量分別為 23.33%、29.75%、23.92%、22.93%，A+G 含量為 53.08%，G+C 含量為46.85%。利用ProtScale 分析蛋白質(zhì)疏水性和親水性，發(fā)現(xiàn)等電點(diǎn)為9.5，不穩(wěn)定系數(shù)為117.83，GRAVY 值為0.672，說(shuō)明Slc7a11 為堿性不穩(wěn)定疏水性蛋白；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有25.10%的阿爾法螺旋；29.08%延伸鏈；45.82%無(wú)規(guī)則有卷曲（圖2）；TMHMM2.0 預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)有12 個(gè)跨膜區(qū)，是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)無(wú)關(guān)的膜受體蛋白。

圖1 Slc7a11 基因結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Slc7a11 gene structur diagram

圖2 Slc7a11 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Figure 2 Prediction of secondary structure of Slc7a11 protein

2.2 Slc7a11基因多態(tài)性分析

針對(duì)獺兔Slc7a11 基因12 個(gè)外顯子設(shè)計(jì)特異性引物，在4 種毛色群體中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。經(jīng)PCR-SSCP 方法檢測(cè)時(shí)未發(fā)現(xiàn)不同帶型（圖3），進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序分析，也未在12 對(duì)外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)SNP 位點(diǎn)（圖4），故認(rèn)為獺兔Slc7a11 基因沒(méi)有多態(tài)性。

圖3 不同毛色獺兔Slc7a11 基因外顯子PCR-SSCP產(chǎn)物分析Figure 3 Analysis of PCR-SSCP products of Slc7a11 exon in different color-colored Rex Rabbits

2.3 pEGFP-N1-Slc7a11真核表達(dá)載體的構(gòu)建

用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否為目的片段，以DL=2 000 Marker 為參照，目的片段為1 509 bp（圖5A），擴(kuò)增結(jié)果條帶單一，無(wú)雜帶，經(jīng)測(cè)序?qū)Ρ却_認(rèn)為目的序列。將Slc7a11 PCR 產(chǎn)物切膠回收后與pEGFP-N1 質(zhì)粒載體連接，經(jīng)克隆提取后用HindⅢ和SacⅡ雙酶切鑒定（圖5B），Slc7a11 基因CDS 區(qū)片段與預(yù)期大小相同，證明pEGFP-N1-Slc7a11 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 Slc7a11 外顯子測(cè)序結(jié)果Figure 4 Sequencing results of Slc7a11 exons

2.4 pEGFP-N1-Slc7a11在RAB-9細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染

在RAB-9 細(xì)胞狀態(tài)良好匯合度約80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況和RT-PCR 檢測(cè)Slc7a11 mRNA 水平，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)載體可以在RAB-9 細(xì)胞中正常表達(dá)，且過(guò)表達(dá)后的載體極顯著提高了 Slc7a11 基因的表達(dá)量（P＜0.05）（圖 6～7）。

2.5 Slc7a11過(guò)表達(dá)對(duì)黑色素生成相關(guān)基因的影響

通過(guò)熒光定量q-PCR 方法檢測(cè)Slc7a11 過(guò)表達(dá)后對(duì)MC1R、SLC24A5 黑色素生成相關(guān)基因的表達(dá)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Slc7a11 的過(guò)表達(dá)會(huì)提高相關(guān)基因的表達(dá)量（P＜0.05），與Slc7a11 基因表達(dá)情況一致（圖 8）。

圖5 Slc7a11 基因PCR 電泳產(chǎn)物Figure 5 Result of Slc7a11 electrophoresis analysis

圖6 Slc7a11 轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞Figure 6 Slc7a11 transfection into fibroblasts

3 討論

在成年動(dòng)物中，毛色和皮膚的顏色都取決于位于皮膚表皮底層的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的色素類(lèi)型[15]。在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)皮膚中發(fā)現(xiàn)的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生兩種黑色素，一是真黑色素產(chǎn)生黑色和棕色，二是褐黑素呈現(xiàn)黃色和紅色[16]。毛色是受色素生物合成過(guò)程中不同基因控制的，其顏色的不同主要由于褐黑色素和真黑色素的不同比例而產(chǎn)生。黑色素的質(zhì)量和比例可以改變色素沉著，導(dǎo)致皮膚、羽毛和眼睛虹膜顏色改變[17]。溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族（solutecarrierfamily，SLC）是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員[18]。Slc7a11 就是SLC 家族的成員之一，涉及褐黑素生成、細(xì)胞遷移和增殖的過(guò)程[11]。它能控制褪黑色素合成從而影響到褐黑素與真黑素的比例，進(jìn)而控制動(dòng)物體內(nèi)被毛顏色這兩種色素[19]。Slc7a11 基因突變的小鼠（sut）毛發(fā)中表現(xiàn)為明顯的偽黑色素水平降低，而真黑色素水平基本不變，從而使黃色背景的野生型小鼠表現(xiàn)為灰色[20]。李洪濤等[10]通過(guò)研究Slc7a11 基因在3 種毛色的哈薩克羊皮膚中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)皮膚中表達(dá)水平最高的是棕色被毛，其次是黑色和白色，這說(shuō)明Slc7a11 基因與哈薩克羊毛色表型有相關(guān)性。何新等[18]利用轉(zhuǎn)睪丸注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)，成功獲得選擇性過(guò)表達(dá)sxCT 的轉(zhuǎn)基因綿羊，綿羊的被毛出現(xiàn)棕黃色斑點(diǎn)，增加了偽黑色素的含量，從轉(zhuǎn)基因角度證實(shí)了該基因?qū)d羊毛色的調(diào)控作用。

圖7 Slc7a11 基因在黑色素細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)檢測(cè)Figule 7 Detected result of Slc7a11 over-express melanocytes

基因組DNA 中任何堿基都有可能發(fā)生突變，所以SNP 既可能出現(xiàn)在編碼區(qū)中也可能出現(xiàn)在非編碼區(qū)中，SNP 多數(shù)存在于內(nèi)編碼區(qū)中，如果編碼區(qū)中發(fā)生堿基突變很有可能導(dǎo)致基因功能發(fā)生改變，從而影響動(dòng)物的表型。本試驗(yàn)對(duì)獺兔Slc7a11 基因的12 個(gè)外顯子進(jìn)行SNP 檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。何軍敏等[21]對(duì)哈薩克羊的Slc7a11 基因檢測(cè)也未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性的存在。未能在該基因中檢測(cè)出SNP，說(shuō)明該基因編碼序列較為保守。

有研究報(bào)道，哺乳動(dòng)物MC1R 基因主要在毛囊和皮膚黑色素細(xì)胞中表達(dá)[22]。該基因的高表達(dá)有利于黑色素細(xì)胞中真黑素的形成，動(dòng)物毛色表現(xiàn)黑或褐毛色類(lèi)型，說(shuō)明細(xì)胞中真黑素含量較高[23]。

圖8 Slc7a11 過(guò)表達(dá)對(duì)毛色生成相關(guān)基因的表達(dá)影響Figure 8 The effect of Slc7a11 over-expression on the expression of coat color related genes

SLC24A5 基因是溶質(zhì)載體24 家族的一個(gè)成員，依賴于鉀離子鈉/鈣陽(yáng)離子的交換體。R.L.Lamason等[24]研究證實(shí)金色表型的斑馬魚(yú)是由SLC24A5 基因變異引起的，CDs 區(qū)208 位點(diǎn)半胱氨酸突變?yōu)榻K止密碼子導(dǎo)致黑色素體變小、密度降低，從而造成黑色素沉積的延緩。此外，SLC24A5 能改變黑素體的pH 值，從而影響酸酶的活性。亦有研究表明SLC24A5的減少將導(dǎo)致黑素體pH 值降低，變酸的黑素體使酪氨酸酶活性降低，導(dǎo)致真黑素生成量減少[25]。前期本課題組通過(guò)試驗(yàn)對(duì)該基因在不同毛色獺兔中mRNA 表達(dá)量的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)Slc7a11 基因在蛋白黃獺兔皮膚中的表達(dá)量最高，與白色、蛋白青和蛋白黃結(jié)果呈差異極顯著（P＜0.01）[26]。為了進(jìn)一步研究Slc7a11 基因與毛色生成的相關(guān)性，本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pEGFP-N1-Slc7a11，提高其在黑色素細(xì)胞中的表達(dá)，然后檢測(cè)MC1R、SLC24A5 在黑色素細(xì)胞中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組相對(duì)高于陰性對(duì)照組，黑色素相關(guān)基因的表達(dá)量顯著提高（P＜0.05）。這些基因在Slc7a11 基因過(guò)表達(dá)后，表達(dá)量均顯著提高。Slc7a11 基因影響了黑色素生成基因，其與毛色形成密切相關(guān)，本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究Slc7a11 基因?qū)γ傻挠绊懱峁┛茖W(xué)依據(jù)。