牛新月，齊素貞，吳黎明，張中印，石明旺,*

1. 河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093

蜜蜂是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，不僅能為人類提供多種綠色健康的蜂產(chǎn)品，而且蜜蜂作為重要的授粉昆蟲，能夠?yàn)檗r(nóng)作物傳花授粉，增加產(chǎn)量和質(zhì)量，并且在瀕危植物、綠化植被及生態(tài)保護(hù)方面都發(fā)揮著重要作用[1-5]。近年來，在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的蜂群衰竭失調(diào)癥(Colony Collapse Disorder, CCD)引起了人們對蜜蜂保護(hù)的極大關(guān)注，并進(jìn)行了系統(tǒng)研究[6-7]。Farooqui[8]曾做過蜂群衰竭失調(diào)癥的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)影響蜂群發(fā)展的脅迫因子很多，包括各種外界因素(氣候、溫度和濕度)，但更主要的原因是化學(xué)農(nóng)藥的濫用[9]。研究表明，有些殺蟲劑可以直接造成蜜蜂死亡，有些殺蟲劑雖不會(huì)直接造成蜜蜂的死亡，但長期亞致死劑量暴露下，會(huì)對蜂群生理代謝、幼蟲生長發(fā)育、工蜂采集和蜂王的生殖力等行為產(chǎn)生消極影響，造成蜜蜂的經(jīng)濟(jì)效益和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受損[10]。當(dāng)今農(nóng)業(yè)發(fā)展離不開農(nóng)藥，因此如何維持蜜蜂數(shù)量與種群可持續(xù)性發(fā)展，已成為全球普遍關(guān)注的生物安全問題[11]。

乙蟲腈(ethiprole)，化學(xué)名稱(R,S)-5-氨基-1-(2,6-二氯-對三氟甲基苯基)-4-乙基亞磺(硫)?；吝?3-腈基，與同類殺蟲劑氟蟲腈具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖1)，但二者對非靶標(biāo)生物的毒性卻相差甚遠(yuǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道氟蟲腈對蜜蜂、甲殼類水生生物風(fēng)險(xiǎn)較高，禁止在花期使用[12-13]，而乙蟲腈對非靶標(biāo)生物毒性則相對較低，在中國、巴西、日本和越南等多個(gè)國家允許在水稻、玉米和大豆等糧食作物上使用[14-17]。目前國內(nèi)外對乙蟲腈的研究主要集中于生物活性、藥效、殘留分析方法、環(huán)境行為及生物體內(nèi)代謝等方面[18-21]，關(guān)于其對非靶標(biāo)生物的毒性作用鮮見報(bào)道。

作為第二代作用于GABA受體的殺蟲劑，乙蟲腈對多種咀嚼式和刺吸式害蟲均有良好防效，特別是極難防治的水稻害蟲稻綠蝽，并且持效期長，在未來的農(nóng)藥市場上具有良好的發(fā)展前景。鑒于以上研究背景和乙蟲腈在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的廣泛使用，為進(jìn)一步明確乙蟲腈對蜜蜂的毒性作用，本研究選取新出房意大利蜜蜂工蜂為研究對象，測定100 g·L-1乙蟲腈懸浮劑對其48 h的急性毒性和7 d、14 d的慢性毒性，并測定蜜蜂體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和乙酰膽堿酯酶(AChE)的活力變化，以及還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量變化，以期為乙蟲腈對蜜蜂影響的作用機(jī)制提供參考，為乙蟲腈的合理使用和風(fēng)險(xiǎn)評估提供科學(xué)依據(jù)，為新農(nóng)藥的開發(fā)創(chuàng)制提供思路。

圖1 乙蟲腈和氟蟲腈的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of ethiprole and fipronil

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試生物

意大利蜜蜂(Apismellifera)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所位于北京市北京植物園的養(yǎng)蜂場提供。供試物對蜜蜂的48 h急性經(jīng)口毒性和7 d、14 d慢性毒性實(shí)驗(yàn)均采用新出房24 h內(nèi)的健康工蜂。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

供試藥劑：100 g·L-1乙蟲腈懸浮劑，商品名酷畢，德國拜耳生產(chǎn)。

供試材料：Bradford蛋白濃度測定試劑盒(P006)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶測定試劑盒(SOD, A001-3)、過氧化氫酶測定試劑盒(CAT, A007-2)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(GST, A004)、還原型谷胱甘肽測定試劑盒(GSH, A006)、丙二醛測定試劑盒(MDA, A003-1)、乙酰膽堿酯酶測定試劑盒(AChE, A024)，均購自南京建成生物工程研究所。

所需儀器：智能人工氣候箱(RXZ-380C，中國，寧波江南儀器制造廠)、醫(yī)用低溫保存箱(DW-86L626Haier，中國，青島海爾特種電器有限公司)、研磨杵(300114，中國，天根生化科技(北京)有限公司)、離心機(jī)(TGL-20M，中國，湖南湘儀動(dòng)力測試儀器有限公司)、酶標(biāo)儀(Spectra Max?i3，中國，美谷分子儀器(上海)有限公司)、紫外可見分光光度計(jì)(UV-1800PC，中國，上海美譜達(dá)儀器有限公司)。

1.3 蜜蜂的急性經(jīng)口毒性測定方法

根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的飼喂法[22-23]測定100 g·L-1乙蟲腈懸浮劑對出房蜂的急性經(jīng)口毒性。首先用蒸餾水將乙蟲腈懸浮劑溶解配制成100 mg·L-1的母液，然后用50%的蔗糖水將母液分別稀釋為0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mg·L-1實(shí)驗(yàn)藥液。實(shí)驗(yàn)開始前，將蜂脾中的新出房蜂轉(zhuǎn)移至貯蜂籠內(nèi)，每籠中10只蜜蜂，饑餓2 h后，采用2 mL注射器吸取1.0 mL實(shí)驗(yàn)藥液懸掛于蜂籠飼喂孔中連續(xù)飼喂48 h，觀察記錄48 h后蜜蜂死亡和中毒情況、累積食物攝入量并計(jì)算48 h-LC50值(mg·L-1)和48 h-LD50值(μg a.i.·蜂-1)[23-24]。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以不含藥劑的50%的蔗糖溶液為空白對照(CK)。

1.4 蜜蜂的慢性毒性測定方法

參照Kling和Schmitzer[25]報(bào)道的意大利蜜蜂慢性毒性實(shí)驗(yàn)方法，采用飼喂法測定100 g·L-1乙蟲腈懸浮劑對蜜蜂的7 d和14 d慢性毒性。根據(jù)乙蟲腈懸浮劑對蜜蜂的急性飼喂?jié)舛群皖A(yù)實(shí)驗(yàn)，慢性毒性的最終實(shí)驗(yàn)濃度為1×10-5、1×10-4、1×10-3mg·L-1，以50%蔗糖溶液為空白對照(CK)。每個(gè)濃度處理分2組進(jìn)行，每組2個(gè)蜂籠，將每20只新出房的蜜蜂轉(zhuǎn)移至一個(gè)貯蜂籠內(nèi)，按1 mL·籠-1·d-1的給藥量連續(xù)飼喂，一組飼喂7 d后收集蜜蜂頭部和腹部樣品，另一組飼喂14 d后收集蜜蜂頭部和腹部樣品。樣品收集時(shí)每3只蜜蜂頭部為一個(gè)樣品處理，每2只蜜蜂腹部為一個(gè)樣品處理，-80 ℃凍存用于后續(xù)生化指標(biāo)測定。實(shí)驗(yàn)過程中每天測定各貯蜂籠內(nèi)試驗(yàn)藥液的消耗量，觀察蜜蜂的死亡情況并更換新配制的實(shí)驗(yàn)藥液。蜜蜂在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)的飼養(yǎng)溫度為(27±1) ℃，相對濕度50%，無光照。

1.5 蜜蜂組織粗酶液的制備及生化指標(biāo)的測定

蜜蜂組織粗酶液的制備參照李夢[26]的方法及試劑盒說明書。準(zhǔn)確稱量蜜蜂頭或腹部組織樣品，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1：9，加入生理鹽水，震蕩5 s后冰上研磨，破碎勻漿后4 500 r·min-1離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定粗酶液中的蛋白濃度，隨后根據(jù)試劑盒說明用于目標(biāo)酶活力和物質(zhì)含量變化的測定。蜜蜂腹部樣品的具體測定指標(biāo)為SOD、CAT和GST酶活力，以及GSH和MDA含量變化；蜜蜂頭部樣品測定指標(biāo)為AChE酶活力；每個(gè)指標(biāo)的測定濃度組設(shè)置3個(gè)樣品處理。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0 Probit分析方法計(jì)算乙蟲腈100 g·L-1懸浮劑對蜜蜂的48 h-LC50和48 h-LD50值及95%置信區(qū)間。慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并用Graphpad prism 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Tukey’s HSD檢驗(yàn)比較處理組與對照組之間的差異，當(dāng)P<0.05(*)、P<0.01(**)時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 乙蟲腈懸浮劑對新出房意大利蜜蜂的急性毒性

經(jīng)過48 h連續(xù)飼喂后，意大利蜜蜂有明顯的中毒癥狀，包括行動(dòng)緩慢、仰躺、顫抖、取食減少和反應(yīng)遲鈍等，且死亡率隨乙蟲腈暴露濃度的增加而增加，死亡蜜蜂身體蜷縮、翅膀呈“一”或“V”字形展開。10%乙蟲腈懸浮劑對新出房意大利蜜蜂的48 h-LC50值為0.21 mg·L-1，95%置信區(qū)間為0.16～0.26 mg·L-1，線性相關(guān)系數(shù)為0.965；相應(yīng)的48 h-LD50值為5.0×10-3μg a.i.·蜂-1，95%置信區(qū)間為1.0×10-3～1.0×10-2μg a.i.·蜂-1，線性相關(guān)系數(shù)為0.867。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2 乙蟲腈懸浮劑對新出房意大利蜜蜂的慢性毒性

乙蟲腈懸浮劑對新出房意大利蜜蜂亦有一定的慢性毒性作用。如圖2所示，經(jīng)過7 d連續(xù)飼喂蔗糖溶液后，對照組中蜜蜂無死亡，處理組中蜜蜂的死亡數(shù)量隨暴露濃度的增加而逐漸增加，累積死亡數(shù)最高為6(10-4mg·L-1處理組)，占總處理蜜蜂的30%，顯著高于對照組。同時(shí)，每個(gè)蜂籠中的累積攝食量呈現(xiàn)下降趨勢，與對照相比(3.1 g)，在10-5、10-4和10-3mg·L-1處理組中的蜜蜂的累積攝食量分別下降了25.2%(顯著)、1.94%(不顯著)和22.6%(顯著)。

表1 10%乙蟲腈懸浮劑對蜜蜂的48 h急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Acute oral toxicity of 10% suspension concentrate (SC) of ethiprole to honey bees after 48 h exposure

圖2 10%乙蟲腈懸浮劑連續(xù)飼喂對意大利蜜蜂成蜂死亡和攝食量的影響Fig. 2 Effect of 10% SC of ethiprole on mortality and food intake of adult bee of Apis mellifera L.

圖3 乙蟲腈懸浮劑對蜜蜂腹部關(guān)鍵酶活性及產(chǎn)物含量變化的影響Fig. 3 Effects of 10% SC of ethiprole on the activities of key enzymes and content of products in bees’ abdomen

隨著連續(xù)飼喂的時(shí)間延長至14 d時(shí)，蜜蜂累積死亡數(shù)量呈現(xiàn)顯著性上升，在對照及3個(gè)處理組中的累積死亡數(shù)量分別為3、5、8和10只；每個(gè)蜂籠的累積攝食量也呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，但整體下降趨勢不明顯，在最高濃度10-3mg·L-1處理組中的累積攝食量為4.34 g，相當(dāng)于對照組(5.18 g)的89.3%，表現(xiàn)為顯著性降低。

2.3 乙蟲腈懸浮劑對意大利蜜蜂腹部關(guān)鍵酶活性和產(chǎn)物含量的影響

當(dāng)蜜蜂連續(xù)攝入含乙蟲腈懸浮劑的糖水后，其腹部各種抗氧化和解毒酶活力均受到了一定的影響。由圖3(a)可知，經(jīng)含乙蟲腈的50%蔗糖水連續(xù)飼喂7 d后，蜜蜂腹部組織的SOD酶活力顯著上升，與對照相比，在10-5mg·L-1和10-4mg·L-1處理組中的上升比例分別為15%和21%，10-3mg·L-1處理組中則變化不顯著。當(dāng)飼喂時(shí)間延長至14 d時(shí)，與對照組相比，各處理組中蜜蜂腹部SOD酶活力沒有發(fā)生顯著變化。

與SOD變化不同，CAT酶活力在7 d時(shí)先下降后上升，14 d時(shí)則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖3(b))，轉(zhuǎn)折點(diǎn)均在10-4mg·L-1，7 d和14 d時(shí)其處理組中的CAT酶活力分別為(31.74±2.46) U·g-1protein、(51.03±3.60) U·g-1protein。

用乙蟲腈懸浮劑連續(xù)飼喂蜜蜂后，其腹部MDA含量的變化見圖3(c)。由圖可知，MDA含量在7 d和14 d處理組中均呈先升后降的趨勢。在連續(xù)飼喂7 d時(shí)，MDA含量在10-5和10-3mg·L-1處理組中與對照組中的(0.71±0.11) nmol·mg-1protein相比變化不顯著，10-4mg·L-1處理組中MDA含量為(0.97±0.05) nmol·mg-1protein，顯著高于對照組。當(dāng)連續(xù)飼喂時(shí)間延長至14 d時(shí)，在10-5和10-4mg·L-1處理組中MDA含量與對照相比無顯著變化，而高濃度10-3mg·L-1處理組中其含量顯著下降，僅為(0.51±0.06) nmol·mg-1protein。

GSTs是昆蟲解毒代謝殺蟲劑的一類關(guān)鍵酶。由圖3(d)可知，經(jīng)過乙蟲腈懸浮劑的飼喂處理后，蜜蜂腹部組織內(nèi)的GST活力顯著上升。處理7 d時(shí)，在10-5和10-4mg·L-1處理組中，蜜蜂腹部組織的GST酶活力分別是(68.76±2.80)、(66.52 ±4.58) U·mg-1protein，相比對照組的(42.22±3.96) U·mg-1protein，顯著上升了61%和63%；在10-3mg·L-1處理組中，GST酶活力是(38.70±4.37) U·mg-1protein，與對照組無顯著差異。當(dāng)乙蟲腈懸浮劑連續(xù)飼喂14 d時(shí)，所有處理組中GST酶活力均與對照差異顯著，在10-3mg·L-1處理組中活力最高，為(181.57±12.34) U·mg-1protein，是對照組(117.64±3.28) U·mg-1protein的1.5倍。

GST是一類催化GSH與各種親電化合物親核加成反應(yīng)的酶，GST的活力變化會(huì)直接引起GSH的含量發(fā)生變化，用乙蟲腈懸浮劑飼喂蜜蜂后，其腹部組織內(nèi)的GSH含量變化見圖3(e)。由圖可知，GSH含量在7 d時(shí)顯著下降，但下降趨勢較緩。在14 d時(shí)，與對照組的(153.44±5.23) μmol·g-1protein相比，GSH含量在10-5和10-4mg·L-1處理組中顯著下降，分別為(140.44±3.57) μmol·g-1protein和(121.22±0.65) μmol·g-1protein；但在10-3mg·L-1處理組中，GSH含量則顯著上升為(208.06±8.88) μmol·g-1protein，是對照組的1.4倍。

2.4 乙蟲腈懸浮劑對意大利蜜蜂頭部AChE活性的影響

乙蟲腈懸浮劑對意大利成蜂頭部AChE活性的影響結(jié)果如圖4所示。處理7 d時(shí)，與對照組相比，處理組意大利蜜蜂頭部AChE酶活力無顯著變化，僅在10-4mg·L-1處理組中顯著下降，下降比例為28%。在14 d時(shí)，意大利蜜蜂頭部AChE酶活力在10-5mg·L-1和10-4mg·L-1處理組中無顯著變化，而在10-3mg·L-1處理組中呈現(xiàn)顯著上升，酶活力比值為(2.83±0.32) U·mg-1protein，是對照組(0.67±0.17) U·mg-1protein的4.2倍。

圖4 乙蟲腈懸浮劑對蜜蜂頭部AChE酶活性變化的影響Fig. 4 Effects of ethiprole 10% SC on AChE activity changes in bees’ head at different exposure time points

3 討論(Discussion)

3.1 乙蟲腈懸浮劑對新出房意大利蜜蜂的毒性效應(yīng)

蒼濤等[27]評估了手性乙蟲腈對3種非靶標(biāo)生物的急性毒性，發(fā)現(xiàn)乙蟲腈外消旋體及2個(gè)對映異構(gòu)體對意大利蜜蜂的48 h-LD50值分別為0.0187、0.0181和0.0188 μg·蜂-1，三者之間無顯著性差異。拜耳公司發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示100 g·L-1乙蟲腈懸浮劑對蜜蜂的48 h接觸LD50為0.067 μg a.i.·蜂-1，48 h經(jīng)口LD50為0.015 μg a.i.·蜂-1[28]。根據(jù)我國農(nóng)藥對蜜蜂毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)，乙蟲腈及其制劑對蜜蜂的接觸和經(jīng)口毒性均為高毒，具有高風(fēng)險(xiǎn)。本研究中10%乙蟲腈懸浮劑對新出房意大利蜜蜂的48 h經(jīng)口LC50為0.21 mg·L-1，根據(jù)蜜蜂取食的糖水體積換算后相應(yīng)的48 h-LD50值約為5.0×10-3μg a.i.·蜂-1，95%置信區(qū)間為1.0×10-3～1.0×10-2μg a.i.·蜂-1，說明10%乙蟲腈懸浮劑對新出房意大利蜜蜂的急性毒性同樣為高毒。如前所述，乙蟲腈為苯基咪唑類的二代殺蟲劑，是一代殺蟲劑氟蟲腈的良好替代藥劑，氟蟲腈對蜜蜂等傳粉昆蟲具有很高的風(fēng)險(xiǎn)，Bovi等[29]測定了乙蟲腈對非洲地區(qū)意大利蜜蜂的24 h攝入和接觸LD50分別為(0.2316±0.0626)和(0.0080±0.0021) μg·蜂-1，與本研究中乙蟲腈對新出房意大利蜜蜂的毒性相近。各研究中報(bào)道數(shù)據(jù)的差異可能與實(shí)驗(yàn)用蜂、暴露及分析方法等因素的不同相關(guān)。

蜜蜂的個(gè)體生長需要經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)階段，當(dāng)蜜蜂成蟲在蛹體內(nèi)發(fā)育完全時(shí)便咬破巢房蠟蓋羽化出房，隨后經(jīng)過數(shù)天的再發(fā)育，出房蜂體內(nèi)各器官發(fā)育成熟，才成為我們常見到的工蜂，因此出房蜂的數(shù)量和健康是保證蜂群健康發(fā)展的關(guān)鍵之一[30]。在我國及經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)現(xiàn)行的化合物環(huán)境安全評價(jià)準(zhǔn)則中，蜜蜂毒性試驗(yàn)所采用的試材均為成年工蜂，通常指常見的采集蜂，這在很大程度上可以反映藥劑對蜂群的綜合毒性和風(fēng)險(xiǎn)。但比較本研究中的急性結(jié)果與報(bào)道數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，新出房意大利蜜蜂可能對乙蟲腈更敏感，可以在低劑量下反映出藥劑對其的毒害作用。而同樣對蜜蜂毒性較高的新煙堿類殺蟲劑而言[31-32]，岳孟[33]指出，在意大利蜜蜂的成蜂階段，隨著日齡的增加其對噻蟲嗪的敏感性也增加，其中采集蜂對噻蟲嗪最敏感(48 h-LC50=20.019 μg·g-1)，新出房蜂最不敏感(48 h-LC50=50.371 μg·g-1)，吡蟲啉具有類似作用效果(新出房蜂：48 h-LC50=48.740 μg·g-1；采集蜂：48 h-LC50=19.276 μg·g-1)，因此新出房意大利蜜蜂對不同藥劑的敏感性差異及機(jī)制還有待研究。鑒于新出房蜂在蜂群發(fā)展中的銜接作用、對藥劑的敏感性和實(shí)驗(yàn)操作的安全性，在未來對化合物的安全性評價(jià)尤其是風(fēng)險(xiǎn)評估研究上，可考慮將新出房蜜蜂作為對化合物毒性評估的早期預(yù)警實(shí)驗(yàn)生物之一。

3.2 乙蟲腈懸浮劑引起意大利蜜蜂工蜂的氧化應(yīng)激反應(yīng)

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是生物體內(nèi)重要的氧自由基，主要包括過氧化物(H2O2)、超氧化物陰離子(O2-)、羥自由基(HO-)、氮氧化物(NOx)等，在正常狀態(tài)下，生物機(jī)體內(nèi)的自由基濃度很低且處于平衡狀態(tài)，發(fā)揮著重要的生理功能。但是當(dāng)環(huán)境中的物理因素或外源化學(xué)物質(zhì)直接或間接對生物體產(chǎn)生脅迫時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量氧自由基，當(dāng)其含量超過機(jī)體的清除能力時(shí)便會(huì)產(chǎn)生氧化損傷，造成機(jī)體損傷、抵抗力下降而死亡[34]。

昆蟲體內(nèi)的抗氧化酶主要包括SOD、CAT、GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)、GR(谷胱甘肽還原酶)、GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)等，面對各種脅迫時(shí)，昆蟲體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，各抗氧化酶發(fā)揮協(xié)同作用清除自由基(圖5)，避免造成更嚴(yán)重的不可挽回的損傷[35]。

圖5 生物體內(nèi)氧自由基清除機(jī)制示意圖注：SOD為超氧化物歧化酶；CAT為過氧化氫酶； GST為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶；MDA為丙二醛；GSH為還原型 谷胱甘肽；GSSG為氧化型谷胱甘肽；AM為外源性物質(zhì)。Fig. 5 Schematic diagram of reactive oxygen species (ROS) deletion in organisms Note: SOD stands for superoxide dismutase; CAT stands for catalase; GST stands for glutathione S-transferase; GSH stands for reduced glutathione; GSSG stands for oxidized glutathione; MDA stands for malondialdehyde; AM stands for allogenic material.

在本研究中，經(jīng)過7 d和14 d的連續(xù)飼喂，10%乙蟲腈懸浮劑引起蜜蜂腹部組織中的SOD、CAT和GST 3種抗氧化酶活力的顯著變化，說明其對蜜蜂形成了一定的氧化脅迫。結(jié)果顯示，7 d時(shí)SOD和CAT的酶活力顯著上調(diào)，在14 d時(shí)則變化不顯著，這說明在乙蟲腈造成的氧化脅迫中，SOD和CAT可能在初期發(fā)揮著更重要的作用，積極清除O2-，降低損傷。

GST是生物體內(nèi)重要的Ⅱ相解毒酶，其一方面可通過催化GSH與有毒疏水親電物質(zhì)的軛合反應(yīng)而達(dá)到解毒目的，另一方面可通過提高抗氧化酶活性而降低氧化損傷[36-38]。用乙蟲腈懸浮劑飼喂蜜蜂7 d后，蜜蜂腹部組織內(nèi)的GST酶活力在較低濃度組中(10-5和10-4mg·L-1)呈上升趨勢，高濃度組(10-3mg·L-1)中則有所降低，GSH的含量先下降后上升，推測GST在此階段可能直接通過代謝解毒作用而積極減少乙蟲腈懸浮劑在蜜蜂體內(nèi)的累積而降低損傷；在14 d時(shí)，蜜蜂腹部GST和GSH均呈現(xiàn)先緩慢下降后急劇上升的趨勢，結(jié)合SOD和CAT酶活力的基本無顯著變化，推測在長期亞致死劑量的累積暴露下，O2-經(jīng)過SOD和CAT的轉(zhuǎn)化后造成H2O2的過量累積，隨之可能同時(shí)激活了GST催化的GSH與外源物質(zhì)結(jié)合的解毒機(jī)制與GSH-GSSG的氧化還原，維持生物體機(jī)能平衡，降低脅迫危害。

在生物體內(nèi)，ROS可與生物膜中的多不飽和脂肪酸和核酸等大分子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，是反映機(jī)體受氧化損傷程度的重要標(biāo)志物[39]。乙蟲腈懸浮劑暴露處理后，蜜蜂腹部組織中MDA含量僅在7 d時(shí)于10-4mg·L-1處理組中上升26%，在14 d時(shí)于10-3mg·L-1處理組中下降22%，但整體變化趨勢不劇烈，且在其他處理組中MDA含量均維持在對照水平，說明用乙蟲腈懸浮劑連續(xù)飼喂蜜蜂后，可引起一定的脂質(zhì)過氧化，但不嚴(yán)重。已有研究證明，將蝌蚪暴露于35、120和180 μg·kg-1劑量的氟蟲腈7 d，蝌蚪體內(nèi)的GST、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、CAT酶活力和MDA含量均受到顯著影響，造成了顯著的氧化脅迫壓力[40]。未來可增加觀測時(shí)間和檢測指標(biāo)種類，評估乙蟲腈是否會(huì)引起蜜蜂體內(nèi)顯著的脂質(zhì)過氧化。

3.3 乙蟲腈懸浮劑影響意大利蜜蜂AChE活性

在田間生態(tài)環(huán)境下，農(nóng)藥殘留水平較低但對蜜蜂造成的慢性危害并不亞于急性致死毒性。在實(shí)驗(yàn)室條件下，Williamson和Wright[41]指出，吡蟲啉、蠅毒磷可造成蜜蜂嗅覺學(xué)習(xí)與記憶能力下降。Henry等[42]研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂接觸亞致死劑量噻蟲嗪后，蜜蜂的定位、采集和歸巢等日?；顒?dòng)均受干擾。Colin等[43]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒劑殺蟲劑能夠引起蜜蜂運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)，如渾身顫抖、動(dòng)作紊亂等表象。新煙堿類殺蟲劑作用靶標(biāo)為乙酰膽堿受體(nAChR)，而AchE是催化乙酰膽堿(Ach)水解為膽堿的關(guān)鍵酶，在昆蟲中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中參與神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞[44-46]，常作為農(nóng)藥檢測的生物標(biāo)記使用。AChE屬于絲氨酸水解酶，在正常情況下，神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)至突觸前膜后釋放ACh，一部分與突觸后膜上的AChR結(jié)合，改變酶的通透性，產(chǎn)生興奮性突觸后電位(EPSP)，繼而傳導(dǎo)信號；使用藥劑后，AChE被抑制，造成酶的磷?；虬被柞；?，酶的活性被鈍化不能正常水解ACh，最終造成神經(jīng)阻塞。此外，AChE對肽類物質(zhì)的代謝和細(xì)胞的發(fā)育、神經(jīng)元電活動(dòng)，乃至神經(jīng)再生發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[47]。蜜蜂頭部富含AChE，其在蜜蜂的學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動(dòng)等方面都發(fā)揮著重要的作用。在意大利蜜蜂的的工蜂和蜂王蛹發(fā)育后期，AChE的活性逐漸增加，出房蜂有最大值，新出房的蜜蜂的可溶性AChE (sAChE)和膜結(jié)合AChE(mAChE)的活性都是最高的[45-46]。苯基吡唑類殺蟲劑的作用靶標(biāo)為昆蟲的γ-氨基丁酸(GABA)受體，干擾神經(jīng)系統(tǒng)門控氯離子通道，造成昆蟲神經(jīng)和肌肉的過度興奮而死亡[47-48]，雖然此類殺蟲劑的直接作用靶標(biāo)不是AChE，但其對昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)造成的影響可在一定程度上反應(yīng)在AChE活性上。

本文發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量下乙蟲腈懸浮劑暴露處理意大利蜜蜂14 d后，其頭部組織中的AChE活性在10-3mg·L-1處理組中顯著升高，說明乙蟲腈可顯著誘導(dǎo)AChE活性，進(jìn)而干擾蜜蜂的神經(jīng)傳遞，誘發(fā)蜜蜂行為的改變。目前關(guān)于乙蟲腈對意大利蜜蜂神經(jīng)毒性作用幾乎未見報(bào)道，但Zaluski等[49]研究發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈對意大利蜜蜂毒性高，致死或亞致死劑量的氟蟲腈(8 μg·L-1)均可抑制蜜蜂的活動(dòng)，表現(xiàn)為蜜蜂活動(dòng)量減少，抽搐、抖動(dòng)和麻痹等；在蜂巢中飼喂含8 μg·L-1氟蟲腈的糖漿時(shí)，蜂群中孵化卵、幼蟲和蛹的數(shù)量以及巢脾上工蜂的覆蓋率均顯著下降，采集蜂表現(xiàn)為嗜睡無力，蜂群發(fā)展受抑制。同時(shí)，在田間暴露下，Zaluski等[50]發(fā)現(xiàn)，2.5 μg·L-1的氟蟲腈與850 μg·L-1的唑菌胺酯聯(lián)合暴露6 d大大降低了工蜂下顎腺的分泌細(xì)胞數(shù)量和儲(chǔ)液體積，二者共同作用下咽下腺中總腺泡數(shù)量沒有受到影響，但卻顯著減少了大腺泡數(shù)量，同時(shí)增加了小腺泡的數(shù)量，進(jìn)而減少了工蜂蜂王漿的分泌量，阻礙蜂群健康發(fā)展。此外，對于同科不同屬的無刺蜂(MeliponascutellarisLatreille)，de Morais等[51]發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈對其的24 h-LD50為0.40 (0.235～0.710) ng a.i.·蜂-1，當(dāng)在0.40、0.040、0.0040 ng a.i.·蜂-1劑量下對采集蜂進(jìn)行點(diǎn)滴處理后發(fā)現(xiàn)，受試蜂的平均爬行速度顯著下降，還可引起蜜蜂昏睡、行動(dòng)困難、麻痹及過度興奮和攻擊行為，更值得關(guān)注的是在最低劑量0.0040 ng a.i.·蜂-1下處理24 h，受試蜂的蘑菇體和觸角神經(jīng)葉中均觀測到明顯的細(xì)胞核異染色體分布和移除，細(xì)胞核、細(xì)胞器及細(xì)胞死亡等均可能引起蜜蜂大腦退化，影響其學(xué)習(xí)、記憶等功能，最終影響蜜蜂生存和蜂群發(fā)展。推測乙蟲腈可能具有相似的作用效果，未來可進(jìn)一步測定10%乙蟲腈懸浮劑在田間生產(chǎn)環(huán)境中的實(shí)際殘留水平，并在此水平上完善其對蜜蜂行為、生理機(jī)能、神經(jīng)毒性和基因毒性的風(fēng)險(xiǎn)評估。