莊娟，李夢(mèng)秋，洪法水，胡衛(wèi)成，張萌萌，周穎君，羅艷，張建梅，鄭元林,*

1. 淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；淮陰師范學(xué)院江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心，淮安 223300 2. 江蘇師范大學(xué)江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，徐州 221116

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一種新型阻燃劑，在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛添加到建筑材料、電子產(chǎn)品、家用電器、塑料以及紡織材料等產(chǎn)品中[1]。PBDEs與材料之間是非化學(xué)鍵相連，因此很容易以揮發(fā)或滲出的方式遷移到環(huán)境中，可經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，且其具有降解周期長(zhǎng)、脂溶性和生物蓄積性強(qiáng)的特點(diǎn)[2]。PBDEs有209種同系物，其中BDE-47是在環(huán)境和生物樣本中檢出率最高、毒性最強(qiáng)的PBDEs之一。文獻(xiàn)證實(shí)，經(jīng)口腔灌胃攝入的BDE-47可以通過(guò)血腦屏障分布至腦[3]，并具有蓄積效應(yīng)[4]。在人類(lèi)腦樣本中，研究者也檢測(cè)到BDE-47的存在[5]。海馬是BDE-47毒作用的重要靶器官，BDE-47可引海馬CA1區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)下降，神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，最終導(dǎo)致自發(fā)行為永久性改變或?qū)W習(xí)記憶缺陷[6-7]。人群調(diào)查結(jié)果顯示，BDE-47與兒童智力發(fā)育遲緩[8]、認(rèn)知能力下降等[9]直接相關(guān)。因此，BDE-47對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒作用及其機(jī)制引起人們的廣泛關(guān)注。

PKC為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在大腦神經(jīng)元突觸可塑性和記憶維持中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10-12]。PKC家族分為3種類(lèi)型：典型的PKC、新型的PKC以及非典型的PKC。典型的PKC有α、β和γ 3種亞型，新型的PKC包括δ、ε、η和θ亞型，而非典型的PKC包括PKCλ/ι、PKCζ和PKMζ[13]。體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，BDE-47可誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)細(xì)胞PKC升高[14]。但BDE-47對(duì)在體海馬組織神經(jīng)細(xì)胞PKC的影響尚不清楚。研究表明，傳統(tǒng)的PKC(PKCα、β和γ)、PKCδ、PKCλ和PKCζ亞型的表達(dá)與記憶形成或神經(jīng)細(xì)胞病理性變化關(guān)系密切[10,15-19]。本研究主要探討這些PKC亞型在BDE-47小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)變化，為明確BDE-47致神經(jīng)毒作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑與儀器

BDE-47，購(gòu)于美國(guó)Chem. Service, West Chester, PA公司，純度大于99%；蛋白酶抑制劑購(gòu)于美國(guó)羅氏(Roche)制藥有限公司；組織蛋白提取液和BCA蛋白定量分析試劑盒購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司；Nissl染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)于SMOBIO公司；PKCα、PKCβ、PKCγ、PKCδ和PKCζ一抗購(gòu)于劍橋abcam公司；PKCλ一抗購(gòu)于美國(guó)BD公司；β-actin一抗、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)抗鼠和抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶顯色液購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；caspase-3活性試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。

德國(guó)萊卡冰凍切片機(jī)(CM3050S)；德國(guó)萊卡顯微鏡(DM4000B)；德國(guó)萊馳混合球磨儀(RETSH MM400)；賽多利斯電子天平(SQP)；美國(guó)ProteinSimple成像系統(tǒng)(FluorChem M)；日本島津紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2501 PC)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7周齡C57BL/6J小鼠45只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)條件：溫度(22±1) ℃、濕度50%±10%、12 h有光/12 h黑暗，自由進(jìn)水和食物。

1.3 動(dòng)物暴露實(shí)驗(yàn)

根據(jù)我們之前的實(shí)驗(yàn)，20 mg·kg-1及以上劑量BDE-47能造成成年小鼠海馬損傷(暴露8周)[20]。因此本實(shí)驗(yàn)我們選取了25和50 mg·kg-1的BDE-47暴露劑量。BDE-47溶解于玉米油。小鼠適應(yīng)1周后分為3組，每組15只：玉米油對(duì)照組，BDE-47(25 mg·kg-1)和BDE-47(50 mg·kg-1)劑量組。小鼠每日按相應(yīng)劑量口腔灌胃一次，連續(xù)處理6周。在處理2、4、6周后小鼠禁食過(guò)夜，于次日9:00—10:00間稱(chēng)體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉并頸椎脫臼處死，迅速取出腦，冰上分離出海馬組織。

1.4 被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)

小鼠染毒6周后進(jìn)行被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在每日10:00—15:00間進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)裝置包括明暗兩箱，兩箱之間有一拱形門(mén)。暗箱底部中間位置的銅柵可通交流電進(jìn)行足部電擊。實(shí)驗(yàn)前一日，小鼠放入明箱，拱形門(mén)打開(kāi)，讓其自由在明暗兩箱內(nèi)活動(dòng)，適應(yīng)環(huán)境5 min。次日實(shí)驗(yàn)，小鼠被放入明箱。小鼠有喜暗習(xí)性，很快穿過(guò)拱形門(mén)進(jìn)入暗箱。小鼠從明箱進(jìn)入暗箱的時(shí)間記錄為潛伏期。待其進(jìn)入暗箱后立即將拱形門(mén)關(guān)閉，同時(shí)給予足部電擊(50 Hz, 5 s)，然后迅速將小鼠拿出放回鼠籠。24 h后，小鼠被再次放入明箱，拱形門(mén)打開(kāi)，但不電擊，記錄潛伏期。記錄時(shí)長(zhǎng)為300 s，如果小鼠在300 s內(nèi)未進(jìn)入暗箱，潛伏期記錄為300 s。同時(shí)記錄小鼠從明箱進(jìn)入暗箱的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)，并記錄小鼠在明暗兩箱內(nèi)運(yùn)動(dòng)的軌跡圖。

1.5 海馬組織病理學(xué)檢測(cè)

海馬組織冰凍切片，切片厚度12 μm。用尼氏染料室溫染色10 min。隨后用50%、70%、80%、95%和100%乙醇脫水，再用二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后觀察。

1.6 組織勻漿與蛋白定量

冰浴條件下加入5倍體積的含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的組織蛋白提取液，用混合球磨儀勻漿(28 frequency·s-1, 30 s)。然后14 000 g、4 ℃離心20 min，收集上清，用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定、caspase-3活性測(cè)定及免疫印跡分析。用BCA protein assay kit進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.7 caspase-3活性測(cè)定

取適量海馬組織勻漿上清液與Ac-DEVD-pNA(2 mmol·L-1)37 ℃孵育2 h。caspase-3催化Ac-DEVD-pNA后生成黃色pNA。在405 nm處檢測(cè)吸光度，根據(jù)pNA標(biāo)準(zhǔn)濃度吸光度曲線計(jì)算pNA量。caspase-3活性單位為nmol pNA·mg-1蛋白。

1.8 蛋白免疫印跡

取50 μg蛋白樣品用10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳。將膠上蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST洗滌后室溫孵育偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗溶液1 h。顯色后用成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。后用Scion Image software program軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey法進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠一般體征和體重的變化

對(duì)照組小鼠皮毛烏黑亮澤，精神狀態(tài)好。染毒后小鼠飲水、攝食和精神狀態(tài)正常。染毒開(kāi)始后每2周測(cè)一次空腹體重，各組小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)顯著差異(圖1)。但與對(duì)照組小鼠相比，BDE-47暴露4周后導(dǎo)致小鼠被毛色澤和順滑度下降。

圖1 2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)暴露對(duì) 小鼠平均體重的影響Fig. 1 The effect of 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether (BDE-47) on the mean body weight of mice

2.2 被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)結(jié)果

被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)一直被用來(lái)檢測(cè)海馬依賴(lài)性記憶[21-22]，也被用來(lái)檢測(cè)PBDEs造成的記憶損傷[23]。被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。在第1天訓(xùn)練期，各組小鼠進(jìn)入暗箱的潛伏期相似。在電擊24 h后測(cè)試階段，對(duì)照組小鼠潛伏期為(196.16±65.12) s，而B(niǎo)DE-47 (25 mg·kg-1)劑量組為(23.18±15.14) s，BDE-47 (50 mg·kg-1)劑量組為(17.43±10.45) s。與對(duì)照組相比，BDE-47顯著縮短了小鼠電擊24 h后的潛伏期(P<0.001) (圖2A)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在電擊24 h測(cè)試階段，對(duì)照組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)為0.8±0.6，而B(niǎo)DE-47 (25 mg·kg-1)劑量組錯(cuò)誤次數(shù)為2.7±0.9，BDE-47 (50 mg·kg-1)劑量組為5.5±1.63。與對(duì)照組相比，BDE-47使小鼠錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多(BDE-47 (25 mg·kg-1):P<0.01; BDE-47 (50 mg·kg-1):P<0.001) (圖2B)。小鼠在明暗箱活動(dòng)軌跡見(jiàn)圖2C，BDE-47使小鼠在明箱的活動(dòng)減少。這些結(jié)果表明，BDE-47暴露導(dǎo)致小鼠24 h記憶能力受損。

2.3 海馬組織病理學(xué)變化

光學(xué)顯微鏡觀察小鼠海馬組織焦油紫染色的情況，結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊且緊湊，神經(jīng)元胞體大而飽滿。BDE-47暴露小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列散亂不規(guī)則，細(xì)胞間空隙增大，神經(jīng)元胞體皺縮體積小。

2.4 BDE-47對(duì)海馬組織PKC表達(dá)水平的影響

小鼠海馬PKC表達(dá)情況見(jiàn)圖4。與對(duì)照組相比，BDE-47對(duì)PKCα、β、γ和ζ亞型的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)，但顯著促進(jìn)了PKCδ和PKCλ的表達(dá)量(BDE-47 (25 mg·kg-1):P<0.05; BDE-47 (50 mg·kg-1):P<0.01)。

2.5 BDE-47對(duì)海馬caspase-3活性的影響

BDE-47對(duì)小鼠海馬caspase-3活性的影響如圖5所示。與對(duì)照組相比，BDE-47顯著提高了海馬caspase-3的活性(BDE-47 (25 mg·kg-1):P<0.05; BDE-47 (50 mg·kg-1):P<0.01)。

3 討論(Discussion)

腦組織是PBDEs重要的靶器官，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，PBDEs對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性，尤其對(duì)嬰幼兒的腦神經(jīng)發(fā)育可造成不可逆的損傷，導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和持續(xù)注意力下降[24]，智力發(fā)育遲緩[8]、閱讀綜合能力降低[25]、認(rèn)知能力下降等[9]。海馬(hippocampus)是參與學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，位于大腦內(nèi)側(cè)顳葉，屬大腦邊緣系統(tǒng)，主要負(fù)責(zé)記憶的儲(chǔ)存轉(zhuǎn)換。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，PBDEs可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入并蓄積在腦組織[4,26]，影響海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)受體和相應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而影響海馬的功能，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降[6,27]。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果表明，BDE-47可造成小鼠被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)24 h記憶保持能力受損。進(jìn)一步病理檢測(cè)結(jié)果顯示，BDE-47導(dǎo)致海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元皺縮變小。這些結(jié)果表明，BDE-47損傷了海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元細(xì)胞，導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。

PKCα、β和γ屬于典型PKC，廣泛表達(dá)于海馬CA1錐體神經(jīng)元，在突觸可塑性和記憶形成中的功能研究由來(lái)已久[28-29,15]。二酰甘油在鈣離子協(xié)同下激活典型PKC，進(jìn)而調(diào)節(jié)突觸蛋白合成、突觸小泡回收以及神經(jīng)遞質(zhì)釋放等[11]。PKCζ屬于非典型PKC，最早于1993年被報(bào)道在生成和維持海馬CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)中發(fā)揮重要作用[30]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，PKCζ與軟骨藻酸的神經(jīng)毒機(jī)制有關(guān)。PKCζ升高后可引起海馬神經(jīng)元凋亡和學(xué)習(xí)記憶能力損傷[18]。但在暴露于BDE-47的小鼠海馬組織中，這些PKC亞型的表達(dá)未發(fā)生顯著性變化，但PKCδ和λ的表達(dá)顯著升高。PKCδ屬于新型PKC，對(duì)氧化壓力敏感，是活性氧調(diào)控的關(guān)鍵下游因子，與細(xì)胞死亡關(guān)系密切[31]。眾多的研究表明，PKCδ表達(dá)升高與多種神經(jīng)毒物的毒作用機(jī)制有關(guān)[32]。神經(jīng)興奮藥甲基安非他命可顯著促進(jìn)紋狀體PKCδ的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[33]。當(dāng)膠質(zhì)細(xì)胞面對(duì)細(xì)菌脂多糖或腫瘤壞死因子等炎癥壓力時(shí)，PKCδ表達(dá)增加，活性增強(qiáng)，并激活PKCδ依賴(lài)性核轉(zhuǎn)錄因子NFκB炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞死亡；PKCδ敲除降低了小鼠對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)毒性的敏感性[34]。在甲基苯丙胺引發(fā)的多巴胺能神經(jīng)毒性中，PKCδ升高后可通過(guò)損傷泛素-蛋白酶體系統(tǒng)[35]，促進(jìn)自噬[36]，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶及抑制核因子2(Nrf2)抗氧化通路[37]導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此我們推測(cè)，BDE-47誘導(dǎo)的PKCδ增加最終會(huì)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，影響海馬神經(jīng)細(xì)胞的功能，導(dǎo)致小鼠記憶損傷。我們隨后檢測(cè)了小鼠海馬組織caspase-3活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BDE-47的確促進(jìn)了caspase-3活性。PKCλ為非典型PKC，在記憶存儲(chǔ)中的作用研究較少。現(xiàn)有的研究顯示，PKCλ在LTP早期表達(dá)階段[38]、后期維持階段和記憶中都發(fā)揮重要作用[39]。Wang等[10]的研究進(jìn)一步表明，PKCλ不僅在LTP中起作用，對(duì)海馬依賴(lài)性長(zhǎng)時(shí)程記憶(LTM)維持也十分重要。此外，Rossner等[40]認(rèn)為，PKCλ具有促進(jìn)神經(jīng)元活性的作用。在非神經(jīng)細(xì)胞中，PKCλ可促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活[41-42]。因此，在BDE-47誘導(dǎo)的小鼠海馬組織中，PKCλ表達(dá)增強(qiáng)可能是機(jī)體對(duì)抗損傷的一種保護(hù)機(jī)制，這需要開(kāi)展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

圖2 BDE-47影響小鼠被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)行為(n=10)注：A. 潛伏期；B. 電擊24 h后小鼠進(jìn)入暗箱的錯(cuò)誤次數(shù)；C. 小鼠在明箱和暗箱中活動(dòng)軌跡圖。與對(duì)照組相比** P<0.01，*** P<0.001。Fig. 2 BDE-47 impairs behavioral performance of mice in the passive avoidance task (n=10) Note: A. the step-through latency in the passive avoidance task; B. the number of error numbers during the 24 h-retention task; C. representative tracks of mice in the light-room and the dark-room. ** P<0.01, *** P<0.001 versus the control group.

圖3 小鼠海馬安蒙角(CA1)區(qū)顯微結(jié)構(gòu)圖(焦油紫染色)(標(biāo)尺：25 μm)Fig. 3 The representative images of the cornu ammonis 1 (CA1) region of mouse hippocampus (stained with crystal violet) (the bar: 25 μm)

圖4 小鼠海馬組織蛋白激酶C(PKC)的蛋白免疫印跡結(jié)果注：A. 代表性小鼠海馬PKCα、β、γ、δ、λ、ζ和β-actin蛋白免疫印跡條帶；B. 蛋白條帶灰度值分析。與對(duì)照組相比，* P<0.05，** P<0.01。Fig. 4 Immunoblotting and densitometry analysis of hippocampal protein kinase C (PKC) in mice Note: A. representative immunoblotting for PKCα, β, γ, δ, λ, ζ and β-actin in mouse hippocampus; B. relative density analysis of the PKCα, β, γ, δ, λ and ζ protein bands. * P<0.05, ** P<0.01 versus the control group.

圖5 小鼠海馬半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3) 活性測(cè)定結(jié)果注：與對(duì)照組相比，* P<0.05，** P<0.01。Fig. 5 The activity of cysteinyl aspartate specific proteinase-3 (caspase-3) in mouse hippocampus Note: *P<0.05, ** P<0.01 versus the control group.