趙云利，洪運，李佳鈺，李仁杰，吳華彰

1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，蚌埠 233030 2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)系，蚌埠 233030

氧化石墨烯(graphene oxide, GO)是石墨粉末化學(xué)氧化及剝離后的產(chǎn)物，通常為單一原子層的薄層。由于其獨特的光、電等特性，以及低廉的生產(chǎn)成本，在生物醫(yī)藥、電子元件和復(fù)合材料等領(lǐng)域嶄露頭角、應(yīng)用前景誘人[1]。然而，氧化石墨烯在給人類帶來巨大經(jīng)濟(jì)利益和技術(shù)突破的同時，也對人類健康與環(huán)境安全產(chǎn)生了潛在的威脅[2]。體內(nèi)外研究顯示GO具有潛在毒性效應(yīng)：進(jìn)入動物體內(nèi)的GO可以分布聚集在腸道、肝臟、腎臟和肺等組織部位，通過誘導(dǎo)血栓的形成、基因表達(dá)改變、線粒體損傷和炎癥反應(yīng)等對動物產(chǎn)生損傷[3-5]；體外研究證實，GO可以降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)caspase-3活性增高、乳酸脫氫酶(LDH)釋放和活性氧(ROS)的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞粘附性改變與凋亡的產(chǎn)生[4,6-8]。因此，GO毒作用機(jī)理被認(rèn)為與氧化應(yīng)激發(fā)生有關(guān)。

在正常的生理狀態(tài)下，人體內(nèi)的氧化與抗氧化體系處于動態(tài)平衡之中。但是，當(dāng)機(jī)體處于饑餓、理化因素刺激等不利環(huán)境時，機(jī)體內(nèi)的這種平衡被打破，自由基、ROS等在機(jī)體內(nèi)累積，導(dǎo)致氧化損傷[9]。機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生過量時，會攻擊脂類、蛋白質(zhì)和DNA等人體的生物大分子，使其結(jié)構(gòu)遭到破壞[9]。這時，機(jī)體可能通過未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)來應(yīng)對錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂所帶來的傷害[10]。已有研究顯示納米材料可以誘導(dǎo)UPR：納米金可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PERK信號通路和UPR信號跨膜感受蛋白肌醇依賴酶1(IRE1)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，納米銀通過caspase-4降解UPR信號跨膜轉(zhuǎn)錄因子6(ATF-6)、通過非經(jīng)典信號通路誘導(dǎo)秀麗線蟲UPR應(yīng)答[11-13]；納米二氧化硅可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR應(yīng)答[14]。但針對非金屬納米材料對UPR應(yīng)答的誘導(dǎo)研究還很少。

鈣穩(wěn)態(tài)的失衡、膜泡轉(zhuǎn)運受損、蛋白降解和氧化應(yīng)激均能誘導(dǎo)線粒體UPR(UPRmt)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR(UPRER)[15-16]。本研究利用秀麗線蟲作為在體模型，旨在探討GO暴露對機(jī)體氧化損傷及UPR應(yīng)答的激活，并通過抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)的保護(hù)作用分析GO誘導(dǎo)的UPR應(yīng)答與氧化應(yīng)激的關(guān)系。秀麗線蟲(C.elegans)是一種在發(fā)育、遺傳等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的模式動物[17]，具有繁殖周期短(2～3 d)、繁殖力高(一只秀麗線蟲可產(chǎn)生約200～300條后代)、周身透明便于觀察、易于培養(yǎng)且成本低廉、遺傳背景清楚等眾多優(yōu)良特性。C.elegans中存在的抗氧化酶與人體的抗氧化酶十分相似，主要是超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)。另外，C.elegans體內(nèi)還含有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和過氧化物酶基因(PRDX)等[18]，C.elegans的抗氧化功能檢測對研究人體抗氧化功能有著重要意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

野生型秀麗線蟲N2、指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)SJ4005(zcIs4[hsp-4::GFP])、線粒體未折疊蛋白反應(yīng)SJ4100(zcIs13[hsp-6::GFP])轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲和尿嘧啶缺陷型大腸桿菌E.coliOP50由美國CaenorhabditisGenetics Center(CGC)提供。

GO按照文獻(xiàn)方法制備[19]。BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所提供， SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 秀麗線蟲培養(yǎng)

野生型和突變體秀麗線蟲培養(yǎng)于秀麗線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)，待大量線蟲處于產(chǎn)卵期時以M9洗下，置于1.5 mL離心管中，M9溶液中含22 mmol·L-1KH2PO4、33.71 mmol·L-1Na2HPO4、85.56 mmol·L-1NaCl和1 mmol·L-1MgSO4，清洗2～3次以去除蟲體表面的食物；加入裂解液(0.45 mol·L-1NaOH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaClO)，待蟲體完全裂解后離心去除裂解液，M9清洗2～3次去除殘留的裂解液。離心搜集卵置于無食物的K buffer(53 mmol·L-1NaCl和32 mmol·L-1KCl)中20 ℃培養(yǎng)12～18 h，即可獲得大量處于L1時期的幼蟲，L1幼蟲經(jīng)過30 h即可發(fā)育到L4時期。

1.2.2 GO暴露實驗

用K-buffer配制不同濃度的GO溶液，使用前混合均勻。采用野生型秀麗線蟲L4幼蟲暴露24 h的急性暴露方法。L4幼蟲置于含有OP50的3.5 cm NGM培養(yǎng)皿上，每皿加200L暴露液，輕輕旋轉(zhuǎn)搖晃，使GO均勻分布于NGM表面。暴露結(jié)束后收集蟲體，提取秀麗線蟲蛋白并立即進(jìn)行酶活性的分析。

1.2.3 GO對秀麗線蟲氧化應(yīng)激水平的影響

LDH是一種穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的糖酵解酶。一般情況下，LDH穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部，但當(dāng)細(xì)胞受到刺激，LDH根據(jù)細(xì)胞膜受損情況而釋放出不同的量，進(jìn)入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過檢測培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)LDH含量，計算出LDH釋放率而推斷細(xì)胞的受損程度。

線蟲體內(nèi)丙二醛(MDA)含量的測定：L4秀麗線蟲暴露24 h后以M9洗下，在冰浴條件下勻漿，1 000 r·min-1，離心20 min，取上清液(每組3個平行樣)，按試劑盒說明測定總蛋白含量和MDA含量。

ROS檢測：采用5-(and-6)-carboxy-2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (CM-H2DCFDA)檢測秀麗線蟲體內(nèi)的氧自由基含量。ROS水平檢測時，將受試秀麗線蟲轉(zhuǎn)移到含有1 μmol·mL-1CM-H2DCFDA的M9緩沖液中20 ℃孵育3 h，然后轉(zhuǎn)移到2%瓊脂平面上，利用激光掃描共聚焦顯微鏡于488 nm激發(fā)波長和510 nm發(fā)射過濾器激發(fā)秀麗線蟲產(chǎn)生熒光并照相記錄。用Image J軟件對所激發(fā)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，以熒光的強(qiáng)弱反映ROS水平(RFU)。每個處理50只線蟲，每個實驗3次重復(fù)。

1.2.4 GO對秀麗線蟲抗氧化酶的影響

GO暴露后秀麗線蟲體內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px的檢測均依照南京建成生物研究所提供的試劑盒進(jìn)行。

GO暴露后秀麗線蟲體內(nèi)SOD酶活性的變化同時采用CF1553 [muIs84[pAD76(sod-3::GFP)]]轉(zhuǎn)基因線蟲檢測GO暴露后秀麗線蟲體內(nèi)SOD-3的實時表達(dá)水平。sod-3::GFP轉(zhuǎn)基因線蟲同步化，L4幼蟲暴露于GO，24 h后置于2%凝膠墊上于熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度變化，實時反映SOD-3表達(dá)水平。

1.2.5 GO對秀麗線蟲UPR的激活

hsp-4和hsp-6轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平：野生型秀麗線蟲暴露于GO，同時以K buffer為對照，暴露結(jié)束后以K buffer洗下秀麗線蟲，Trizol法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA純化和cDNA合成，用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行實時定量分析，以act-1為內(nèi)參進(jìn)行均一化，△△Ct計算hsp-4和hsp-6基因的相對表達(dá)水平。

HSP-4和HSP-6蛋白水平檢測：SJ4005(zcIs4[hsp-4::GFP] V)和SJ4100(zcIs13[hsp-6::GFP])轉(zhuǎn)基因線蟲同步化，L4幼蟲暴露于GO，24 h后轉(zhuǎn)移到2%瓊脂糖凝膠墊上，熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度變化，用Image J軟件對所激發(fā)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，以相對熒光單位(RFU)表示。

1.2.6 GSH的保護(hù)作用

將同步化后的卵放置在含有5 mmol·L-1GSH的NGM培養(yǎng)基上孵化，直至L4時期[20]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 GO對秀麗線蟲機(jī)體氧化應(yīng)激水平的影響

如圖1所示，GO短期暴露可以引起秀麗線蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激水平上升，機(jī)體各種氧化指標(biāo)呈上升趨勢。隨著GO暴露濃度的增加，秀麗線蟲體內(nèi)ROS的積累逐漸增加(圖1a、b)。秀麗線蟲體內(nèi)MDA含量也隨著GO濃度的增加而逐漸增加，10 mg·L-1GO暴露24 h就可導(dǎo)致秀麗線蟲MDA含量升高(圖1b)。同樣，GO暴露秀麗線蟲體內(nèi)LDH含量也隨著GO暴露濃度的增加而逐漸上升，呈劑量依賴性(圖1c)。

2.2 GO對秀麗線蟲機(jī)體抗氧化酶活性的影響

隨著機(jī)體氧化應(yīng)激水平上升，SOD、GSH-Px等清除自由基和抗氧化的酶活性也隨之增加，以維持機(jī)體的氧化-抗氧化狀態(tài)處于一個新的平衡，但當(dāng)GO濃度達(dá)到500 mg·L-1時，SOD、CAT和GSH-Px活性不再增加，SOD和GSH-Px活性甚至有所下降(圖2)。

進(jìn)一步選擇sod-3::GFP轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲以100 mg·L-1GO進(jìn)行短期暴露，結(jié)果顯示GO處理24 h可以顯著增加秀麗線蟲體內(nèi)SOD-3表達(dá)水平，尤其是腸道部位SOD-3表達(dá)水平(圖3)。

圖1 氧化石墨烯(GO)對秀麗線蟲機(jī)體氧化應(yīng)激水平的影響注：a和b為GO對秀麗線蟲活性氧簇(ROS)的誘導(dǎo)。*、**與對照相比有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05、P<0.01。Fig. 1 Effects of graphene oxide (GO) exposure on intestinal oxidative stress of C. elegans Note: a and b show the intestinal production of reactive oxygen species (ROS) after GO exposure. * P<0.05 vs. control; ** P<0.01 vs. control.

圖2 GO對秀麗線蟲機(jī)體抗氧化酶活性的影響注：*、**與對照相比有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05、P<0.01。Fig. 2 Effects of GO exposure on the antioxidant enzyme levels in C. elegans Note: * P<0.05 vs. control; ** P<0.01 vs. control.

圖3 GO對秀麗線蟲SOD-3表達(dá)水平的影響注：**與對照相比有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01。Fig. 3 Effects of GO exposure on the expression of SOD-3 in C. elegans Note: ** P<0.01 vs. control.

2.3 GO誘導(dǎo)秀麗線蟲未折疊蛋白反應(yīng)

qRT-PCR結(jié)果顯示，100 mg·L-1GO暴露后秀麗線蟲UPRER和UPRmt的指示基因hsp-4和hsp-6的表達(dá)水平均較對照有明顯升高(圖4a)。進(jìn)一步以100 mg·L-1GO暴露內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR(hsp-4作為報告基因)和線粒體UPR(hsp-6作為報告基因)的轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲，暴露結(jié)束后熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，GO暴露后，hsp-4::GFP和hsp-6:GFP秀麗線蟲體內(nèi)的熒光水平明顯增強(qiáng)，說明GO可以誘導(dǎo)秀麗線蟲UPRER和UPRmt應(yīng)答(圖4b)。

為進(jìn)一步探討GO誘導(dǎo)的UPR反應(yīng)與氧化應(yīng)激的關(guān)系，我們采用GSH進(jìn)行抗氧化保護(hù)，然后檢測秀麗線蟲對GO誘導(dǎo)的UPR反應(yīng)。結(jié)果顯示，以GSH預(yù)處理秀麗線蟲可以明顯降低秀麗線蟲UPRER和UPRmt應(yīng)答代表基因hsp-4和hsp-6轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)(見圖4)，暗示著降低氧化應(yīng)激可以部分抑制UPR反應(yīng)。

3 討論(Discussion)

正常條件下，機(jī)體的氧化還原體系保持動態(tài)平衡，而外源化學(xué)物的刺激可以打破機(jī)體的這種平衡，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究顯示GO短期暴露可以引起秀麗線蟲體內(nèi)氧化應(yīng)激水平上升，ROS水平、MDA含量和LDH含量隨著GO濃度的增加而上升(圖1)。相應(yīng)的，為保持機(jī)體的氧化-抗氧化體系的動態(tài)平衡、清除機(jī)體過多的自由基，秀麗線蟲體內(nèi)的抗氧化酶類也隨之上升。在GO濃度低于100 mg·L-1時，秀麗線蟲體內(nèi)的SOD、GSH-Px等清除自由基和抗氧化的酶活性也隨GO濃度的增加而升高，機(jī)體的氧化-抗氧化狀態(tài)處于一個新的平衡(圖2)。但當(dāng)GO的濃度達(dá)到500 mg·L-1時，SOD和GSH-Px活性不再增加反而有所下降，可能是由于高劑量GO所致的氧化應(yīng)激超出了機(jī)體抗氧化的清除能力，增加了抗氧化酶的消耗，氧化-抗氧化的平衡被打破(圖2)。

在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，自由基、ROS等在機(jī)體內(nèi)累積，攻擊蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子使其結(jié)構(gòu)被破壞，造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的失衡，進(jìn)而使呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和心肌系統(tǒng)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)疾病[21-22]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的重要場所，線粒體調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)信號通路。環(huán)境應(yīng)激會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成過快以至于超過蛋白折疊能力、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂等引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[20]；大量錯誤折疊或未折疊蛋白堆積在線粒體則會造成線粒體功能紊亂[15]。未折疊蛋白反應(yīng)是機(jī)體通過監(jiān)督和識別未正確折疊與修飾的蛋白質(zhì)，引起一系列特定的靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平下調(diào)，從而維持細(xì)胞正常功能的一種自我保護(hù)機(jī)制[10]。hsp-4編碼哺乳動物grp78/BiP的同源物，是秀麗線蟲UPRER的指示[23]，hsp-6編碼dnak/hsp70分子伴侶超級家族成員的線粒體特異性轉(zhuǎn)錄因子受體，常作為UPRmt的指示[24]。研究結(jié)果提示，GO可以誘導(dǎo)秀麗線蟲UPRER和UPRmt應(yīng)答，而抗氧化劑GSH的保護(hù)可以有效降低UPRER和UPRmt應(yīng)答，說明GO誘導(dǎo)的UPR反應(yīng)是與氧化應(yīng)激相關(guān)的(見圖4)。Runkel等[15]發(fā)現(xiàn)抗氧化劑可以抑制UPRmt，潘麗等[25]發(fā)現(xiàn)丙烯腈(ACN)引起的大鼠肝臟氧化損傷是引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)發(fā)生的原因之一，這與本研究結(jié)果相似。因此推測，機(jī)體在氧化應(yīng)激條件下可以激活UPR應(yīng)答，通過啟動UPR降低機(jī)體未能正確折疊或修飾的蛋白質(zhì)，進(jìn)而提高機(jī)體應(yīng)對和緩解應(yīng)激的能力，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

圖4 GO誘導(dǎo)秀麗線蟲未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)及谷胱甘肽(GSH)的保護(hù)作用注：a. GO對hsp-4和hsp-6轉(zhuǎn)錄水平的影響；b. GO對HSP-4和HSP-6蛋白水平的影響。 *、**與對照相比有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05、P<0.01。#與GO暴露組相比有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。Fig. 4 The unfolded protein response (UPR) induced by GO and the protection effects of glutathione (GSH) in C. elegans Note: a. transcriptional regulation of GO on hsp-4 and hsp-6; b. effects of GO on the protein levels of HSP-4 and HSP-6. * P<0.05 vs. control; ** P<0.01 vs. control; # P<0.05 vs. GO group.