陳 旭，蔡茜茜，汪少蕓,*，楊傅佳，吳金鴻

（1.福州大學(xué)石油化工學(xué)院，福建 福州 350108；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

低溫冷鏈技術(shù)是長期貯存食物最常見有效的手段之一。而食品在低溫冷鏈中冷凍、貯存、運輸和凍融過程導(dǎo)致的冰晶生長和重結(jié)晶問題是制約產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵[1-2]。溫度的反復(fù)波動使產(chǎn)品不斷遭受冰晶生長、凍融和重結(jié)晶帶來的傷害，損傷細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，從而使產(chǎn)品失去原有的品質(zhì)，其導(dǎo)致的質(zhì)量破壞和巨大經(jīng)濟(jì)損失越來越受到人們的關(guān)注[1]。全球范圍內(nèi)的相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)家正面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1-2]：如何控制冰晶生長及重結(jié)晶，實現(xiàn)低溫冷鏈過程中抑制產(chǎn)品的冰晶生長，是保證眾多食品品質(zhì)的關(guān)鍵所在。

目前，添加抗凍劑是緩解冷凍食品在冷鏈過程中品質(zhì)劣變的有效方法之一。傳統(tǒng)食品中的商業(yè)抗凍劑多為多聚磷酸鹽類、糖類、醇類及其復(fù)配物。多聚磷酸鹽的添加受到嚴(yán)格限制，添加量偏高時食品有苦澀味，磷酸鹽攝入量高會影響人體鈣質(zhì)吸收[3]，并且多聚磷酸鹽的攝入會加重高血壓及慢性腎病患者癥狀；而蔗糖等糖類抗凍劑由于其熱量、甜度高等因素不利于高血糖、糖尿病患者及肥胖人群，從而限制了其使用范圍。此外，高濃度的糖醇類及多聚磷酸鹽類抗凍劑雖然能減小冷藏過程中形成的冰晶顆粒，但是冷鏈過程中的溫度波動會使小冰晶發(fā)生重結(jié)晶，冰晶顆粒變大，破壞食品原本的組織結(jié)構(gòu)，造成營養(yǎng)成分流失，同樣造成冷凍食品的品質(zhì)下降[4]。

處于高寒、高海拔地區(qū)生物體經(jīng)過長期自然環(huán)境選擇，應(yīng)激性地產(chǎn)生一類活性蛋白——抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP），用以抵御外界嚴(yán)寒環(huán)境?？箖龅鞍椎淖畲筇攸c就是能吸附在冰晶表面，從而制約冰晶生長，抑制冰晶重結(jié)晶，改變冰晶形態(tài)，因此抗凍蛋白亦稱為冰結(jié)構(gòu)蛋白[5]。伴隨著多種抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)和研究的深入[6-12]，制約天然抗凍蛋白在食品領(lǐng)域中研究和應(yīng)用的兩大關(guān)鍵問題也日益凸顯：1）天然分離純化所得到的抗凍蛋白數(shù)量微少，非常有限的數(shù)量制約了其在食品工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用前景；2）當(dāng)科學(xué)家致力于轉(zhuǎn)基因技術(shù)以擴(kuò)大生物體來源的抗凍蛋白產(chǎn)量時，轉(zhuǎn)基因抗凍蛋白在食品應(yīng)用中的安全性顧慮又成為廣大消費者、歐盟組織和美國食品藥品監(jiān)督管理局所共同擔(dān)憂的焦點問題[2,12]。因此，具有高活性的食源性抗凍肽成為近年來的研究熱點。本文根據(jù)近年來國內(nèi)外研究的最新報道，綜述了抗凍肽研究進(jìn)展及前景，以期為抗凍肽作為新型抗凍劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 抗凍肽的來源

抗凍蛋白主要來源于高寒、高海拔等極端條件下生長的魚、昆蟲、細(xì)菌和植物等生物體內(nèi)。抗凍蛋白按其來源可分為魚源抗凍蛋白、昆蟲源抗凍蛋白、細(xì)菌源抗凍蛋白和植物源抗凍蛋白4 類；按照活性可分為：AFP I～I(xiàn)V、hyperactive-AFP和抗凍糖蛋白[13-17]。天然源抗凍蛋白本身生物體內(nèi)含量極低、純化成本高，純化過程中活性損耗較大，限制了抗凍蛋白的研究與規(guī)模化應(yīng)用。

而抗凍肽主要以食源性蛋白源為原料，通過特異性的酶切位點水解獲得，具有可控、高效的制備特點。目前報道的食源性抗凍肽多以食用明膠[18-19]或者動物皮[20-25]、魚鱗[26]等加工副產(chǎn)物制備得到。有研究報道抗凍肽分子結(jié)構(gòu)一般具有Gly-Pro-x三肽重復(fù)序列、GTPG-和GPP(OH)G-結(jié)構(gòu)指紋等結(jié)構(gòu)特征，且一般具有特定的氨基酸序列長度，其分子質(zhì)量一般小于2 000 Da[21,23-25]。

2 抗凍肽的性質(zhì)

2.1 熱滯活性

抗凍蛋白能特異性地降低溶液的冰點而不影響其熔點，這樣冰點與熔點間產(chǎn)生的差值稱為熱滯活性。目前研究結(jié)果認(rèn)為抗凍蛋白主要通過結(jié)合到冰晶表面，使得冰晶曲面變大，曲面變大使蒸汽壓力升高，導(dǎo)致冰點降低，從而起到降低溶液冰點的作用，也就是所謂的Kelvin效應(yīng)[27]。Liu Kai等[28]通過分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，抗凍蛋白存在Janus效應(yīng)，即存在“冰結(jié)合面”和“非冰結(jié)合面”2 種不同面。其中冰結(jié)合面能形成一種“類冰”的結(jié)構(gòu)結(jié)合在冰核表面，而非冰結(jié)合面能抑制冰晶形成。如圖1所示，抗凍蛋白一旦結(jié)合在冰核表面，新的冰層需跨過非冰結(jié)合面空隙，進(jìn)而冰核表面曲率變大[29-30]，所需要越過的能壘就越高，導(dǎo)致局部凝固點亦隨之下降，從而使整個體系的冰點下降。

圖1 抗凍蛋白與冰晶結(jié)合模型圖[29]Fig. 1 Model diagram of AFPs combined with ice crystal[29]

研究表明，抗凍蛋白的抗凍活性片段只存在于局部的特異多肽鏈結(jié)構(gòu)域，其抗凍活性并不是整體蛋白質(zhì)在起作用[31-32]。洪晶[22]和Wu Jinhong[33]等同樣通過分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，具有特定氨基酸長度和結(jié)構(gòu)的膠原抗凍肽能夠通過氫鍵與冰層結(jié)合，再通過疏水相互作用協(xié)同起到抑制冰晶形成的作用，說明抗凍蛋白的Kelvin效應(yīng)同樣適用于抗凍肽，一樣具有熱滯活性。

2.2 重結(jié)晶抑制活性

圖2 冰晶重結(jié)晶示意圖[33]Fig. 2 Diagram of ice recrystallization[33]

當(dāng)溫度低于融點時，冰晶有聚集的趨勢，重結(jié)晶效應(yīng)是冰晶間聚集，小冰晶聚集形成大冰晶，如圖2所示，在－14～－12 ℃間經(jīng)過5 次凍融循環(huán)后冰晶顆粒明顯增多。而抗凍肽的重結(jié)晶抑制效應(yīng)則能夠調(diào)控冰晶，防止冰晶聚集，使得冰晶的大小和形狀得以調(diào)控，形成的冰晶細(xì)小均勻。在氫鍵、疏水相互作用和范德華力作用下[34]，抗凍肽可以調(diào)控冰晶[35-36]，降低冰晶對有機體造成的機械損傷[37]。據(jù)報道，在生物體內(nèi)抗凍蛋白的重結(jié)晶抑制活性高低相比于熱滯活性更為重要。而抗凍蛋白或抗凍肽只需添加極少量就能有較高的重結(jié)晶抑制活性[33,38-39]。

2.3 細(xì)胞膜保護(hù)作用

當(dāng)細(xì)胞處于結(jié)冰或者過冷狀態(tài)時，細(xì)胞周圍及內(nèi)部環(huán)境產(chǎn)生的冰晶會對細(xì)胞造成機械損傷，冷應(yīng)激會誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而加速細(xì)胞死亡。Hirano[40]、Tatsuro[41]以及Davies[42]等報道了魚類抗凍蛋白能夠保護(hù)細(xì)胞膜免受低溫傷害。Jessie等[43]研究發(fā)現(xiàn)在昆蟲細(xì)胞膜上的部分抗凍蛋白在冰點以下能增強細(xì)胞活力。Tomczak等[44]認(rèn)為抗凍蛋白能與細(xì)胞膜上的磷脂基團(tuán)結(jié)合，提高細(xì)胞膜相變溫度，降低冰晶對細(xì)胞膜損傷，進(jìn)而防止細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，從而提高生物體的抗寒性。Chen Xu[26]和Wang Wenlong[45]等研究發(fā)現(xiàn)，抗凍肽同樣可能通過與細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層結(jié)合（圖3），起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

圖3 抗凍肽與細(xì)胞相互作用模型圖[26]Fig. 3 Schematic illustration of the interaction between antifreeze peptides and cells[26]

3 抗凍肽的作用機制

3.1 “親水-互補”模型

基于活性分子氨基酸序列結(jié)構(gòu)，汪少蕓[21,23]以及Damodaran[25]等發(fā)現(xiàn)抗凍肽分子結(jié)構(gòu)一般具有Gly-Pro-x三肽重復(fù)序列和GTPG-、GPP(OH)G-結(jié)構(gòu)指紋等結(jié)構(gòu)特征；進(jìn)一步結(jié)合分子動力學(xué)模擬技術(shù)，構(gòu)建了抗凍肽與冰結(jié)構(gòu)分子表面相互作用理論模型，闡明了抗凍肽與冰結(jié)構(gòu)分子的作用機制服從表面親水-互補作用模式[21-22]（圖4），即具有特定氨基酸長度和結(jié)構(gòu)的膠原抗凍肽在冰核棱晶面內(nèi)與水分子形成氫鍵，多肽分子通過氫鍵結(jié)合于冰核棱晶的表面，分子質(zhì)量小于2 000 Da的肽鏈具有足夠的親水性、柔韌性，同時抗凍肽富含的脯氨酸和丙氨酸殘基等烷基側(cè)鏈可以提供部分非極性環(huán)境以穩(wěn)定氫鍵間的作用，并能夠?qū)贡?水之間氫鍵相互作用的競爭性，使之表現(xiàn)出顯著的冰晶抑制活性。

此外，Wu Jinhong等[33]應(yīng)用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)解析得到來源于絲膠肽的新型抗凍肽SM-AFP的氨基酸序列結(jié)構(gòu)為TTSPTNVSTT，并通過化學(xué)合成制備此肽段，結(jié)合活性分析和分子模擬分析，確證其具有抗凍活性并且其與冰晶相互作用的主要方式為氫鍵、疏水相互作用和一些非鍵相互作用。

圖4 抗凍肽與冰結(jié)構(gòu)層表面親水-互補作用模型圖[21-22]Fig. 4 Surface hydrophilic-complementary interaction between antifreeze peptides and ice molecules[21-22]

3.2 “吸附-抑制”學(xué)說

吸附抑制學(xué)說最早由Raymond等在1977年提出，他們認(rèn)為抗凍蛋白吸附在冰晶表面通過Kelvin效應(yīng)抑制其生長[46]。其機制的模型為：在純水體系中，冰晶主要沿a軸方向垂直于晶體表面生長（圖5A），如果有其他雜質(zhì)分子吸附于冰晶生長途徑的表面，這就需要再外加一推動力促使冰晶在雜質(zhì)間生長。這種生長結(jié)構(gòu)導(dǎo)致冰晶曲率變大，使邊緣的表面積也增大，抑制正常狀態(tài)下冰晶的生長方向，導(dǎo)致冰晶形態(tài)發(fā)生變化（圖5B）[47-50]。

圖5 冰晶生長軌跡Fig. 5 Trajectory of ice crystal growth

這一學(xué)說同樣適用于抗凍肽分子，汪少蕓[21]和Wu Jinhong[33]等研究發(fā)現(xiàn)，具有特定氨基酸長度和結(jié)構(gòu)的抗凍肽，能在冰晶的棱晶面內(nèi)與水分子形成氫鍵，通過氫鍵緊密吸附于冰核表面，從而起到改變冰晶生長軌跡，抑制冰晶生長及重結(jié)晶的作用。

4 抗凍肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用

隨著全球貿(mào)易的增長和產(chǎn)銷間距的擴(kuò)大，冷鏈加工食品的需求也隨之增加。冷凍食品在食品工業(yè)中所占的份額也日益增長。然而，冷凍食品通常水分含量較高，在冷鏈過程中水分形成冰晶，冰晶變大及重結(jié)晶對冷凍食品所造成的品質(zhì)下降是冷凍食品所面臨的巨大挑戰(zhàn)[51]?？箖鲭淖鳛橐活愋滦褪称诽砑觿?，可以有效減少冷鏈過程食品中冰晶的形成和重結(jié)晶，從而提高低溫冷鏈?zhǔn)称返钠焚|(zhì)。

4.1 冰淇淋

冷藏過程中冰晶的生長是冰淇淋等冷凍產(chǎn)品制造商面臨的主要挑戰(zhàn)之一，因為在冷藏和處理過程中溫度的波動會促進(jìn)冰晶的生長，影響冰淇淋口感，使產(chǎn)品品質(zhì)下降。眾所周知，冰晶的大小與粗糙程度和/或冰晶結(jié)構(gòu)的形成之間有著直接的密切關(guān)系。因此，在冰淇淋生產(chǎn)配方、加工、貯藏和分銷條件等環(huán)節(jié)都必須努力減小冰晶尺寸和減少重結(jié)晶的發(fā)生，因為冰晶大小及重結(jié)晶的形成均會對冰淇淋質(zhì)地產(chǎn)生較大影響[52-55]。

Wang Shaoyun[18-19]和Damodaran[25]等利用膠原蛋白水解篩分出冰結(jié)構(gòu)肽，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這類冰結(jié)構(gòu)肽能明顯減小冰淇淋中冰晶尺寸，并且通過冷熱循環(huán)系統(tǒng)模擬冷鏈過程中的溫度波動，發(fā)現(xiàn)該類冰結(jié)構(gòu)肽能明顯抑制冰淇淋中冰晶重結(jié)晶。在－14～－12 ℃之間分別經(jīng)過7 次和25 次凍融循環(huán)的空白組（圖6A、C）冰晶尺寸明顯大于添加4%冰結(jié)構(gòu)肽的實驗組（圖6B、D）。

圖6 冰結(jié)構(gòu)肽對－14～－12 ℃凍融后冰淇淋冰晶生長的影響[19]Fig. 6 Effect of ice-structuring peptides on ice crystal growth in an ice cream mix after 7 and 25 freeze-thaw cycles at ?14 to ?12 ℃[19]

4.2 益生菌

益生菌是食品加工過程中常用的有益菌，也是分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、微生物學(xué)和傳染病研究的關(guān)鍵載體[56]。菌種長時間的連續(xù)培養(yǎng)不僅耗時耗力，而且不切實際，因此，在工業(yè)應(yīng)用和學(xué)術(shù)研究中通常采用低溫保存和冷凍干燥技術(shù)[57]。然而，冷應(yīng)激處理時會發(fā)生各種物理化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞存活率及細(xì)胞代謝活力降低等不良現(xiàn)象。如圖7所示，細(xì)菌、細(xì)胞在冷凍及冷凍干燥過程中主要受到的損傷包括：溶質(zhì)損傷、機械損傷、細(xì)胞膜及結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)和DNA變性5 個方面。此外，大量研究表明，低溫保存也可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)[58-62]。低溫保存通常需要添加有機溶劑，以減少冰晶形成和生長以及膜破裂和滲透脅迫造成的損害，否則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[63]。對于細(xì)菌來說，甘油是應(yīng)用最廣泛的低溫保護(hù)劑，用于緩慢冷凍和玻璃化（取決于甘油濃度），對于哺乳動物細(xì)胞，通常使用二甲基亞砜。盡管這些方法非常成功，并在全球范圍內(nèi)得到了應(yīng)用，但它們同樣對細(xì)胞具有不可逆損害。典型的低溫貯藏需要高質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%～40%）的有機溶劑，這種有機溶劑可能存在細(xì)胞毒性影響并造成不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞損傷[64-65]。

圖7 冷凍過程中細(xì)胞主要損傷Fig. 7 Major cell damages during freezing

細(xì)胞膜表面通常含有大量的水分，這些水分與磷脂的極性頭部PO2－通過氫鍵結(jié)合，在細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層周圍形成一層水化層，從而起到維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能的作用。但是在冷凍過程中這部分水會形成冰晶，加速菌體細(xì)胞機械損傷。針對這些問題，汪少蕓課題組以益生菌為模式菌，篩選得到系列新型抗凍肽，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量集中在180～2 000 Da的抗凍肽活性最佳[29]?？箖鲭哪茱@著提高益生菌冷凍存活率、冷凍穩(wěn)定性和維持菌體細(xì)胞代謝活力[66-69]。此外，抗凍肽一方面能與細(xì)胞膜通過氫鍵形式結(jié)合保護(hù)細(xì)胞膜，減少胞內(nèi)物質(zhì)泄漏[45]；另一方面抗凍肽能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶對細(xì)胞的損傷[26]。

4.3 冷凍面團(tuán)

現(xiàn)代冷凍技術(shù)是解決傳統(tǒng)主食易老化、貨架期短等難題的有效手段。然而，長時間的冷鏈過程中，由于冰晶的長大及小顆粒冰晶的重結(jié)晶會導(dǎo)致冷凍面團(tuán)等制品出現(xiàn)面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞的現(xiàn)象，活力酵母細(xì)胞受損或死亡，最終導(dǎo)致冷凍面團(tuán)醒發(fā)難，比容減小及產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性下降等劣變[70-72]。因此，近年來學(xué)者們試圖挖掘各種抗凍劑，用于改善冷凍面團(tuán)制品的貯藏穩(wěn)定性，提升冷凍面團(tuán)制品品質(zhì)。

抗凍肽或冰結(jié)構(gòu)多肽作為一種新型食品抗凍劑，近年來將其應(yīng)用于冷凍面團(tuán)制品低溫保藏的相關(guān)研究屢見報道。其中，福州大學(xué)汪少蕓團(tuán)隊、江南大學(xué)張暉團(tuán)隊和黃衛(wèi)寧團(tuán)隊等成功將抗凍肽應(yīng)用于冷凍面團(tuán)[73-75]、冷凍馬鈴薯面團(tuán)[76-77]。如圖8所示，添加抗凍肽后，冷凍面團(tuán)的發(fā)酵時間相比于對照組顯著縮短（圖8A），冷凍后比容顯著高于對照組。此外，研究還發(fā)現(xiàn)由添加抗凍肽冷凍面團(tuán)制作的饅頭比容明顯高于對照組（圖8B）。

圖8 抗凍肽對冷凍面團(tuán)發(fā)酵時間（A）和比容（B）的影響[74]Fig. 8 Effect of antifreeze peptides on fermentation time (A) and specific volume (B) of frozen dough[74]

4.4 冷凍肉

目前，全球肉類出口總額超過130億 美元，冷凍技術(shù)在確保供應(yīng)世界各地肉類產(chǎn)品安全方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，冷凍和解凍對肉類品質(zhì)的影響仍然是一個重大問題[78]。反復(fù)凍融主要影響肉的水分含量。由于水分包含在肌肉纖維內(nèi)部和間隙處，當(dāng)水分結(jié)冰時，剩余溶質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、礦物質(zhì)和維生素）的濃度增加，凍結(jié)過程和冷鏈過程中冰晶長大、重結(jié)晶，從而破壞了復(fù)雜的肉類系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，損害肉類原本的組織結(jié)構(gòu)[78-80]。

李曉坤[81]報道了抗凍肽應(yīng)用于魚糜的低溫保護(hù)作用，在新鮮制備的魚糜中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、8%抗凍肽以及8%商業(yè)抗凍劑，于－18 ℃凍藏，測定二硫鍵含量、巰基含量、表面疏水性、鹽溶性蛋白含量、Ca2＋-ATPase活力在凍藏過程中的變化，進(jìn)而研究蛋白質(zhì)的冷凍變性情況。結(jié)果表明，抗凍肽可以抑制魚糜中二硫鍵含量和表面疏水性的增加，保留巰基和鹽溶性蛋白含量，抑制Ca2＋-ATPase活力的降低。其中添加8%抗凍肽的效果最佳，其次是添加4%抗凍肽、8%商業(yè)抗凍劑、2%抗凍肽。

5 結(jié) 語

添加抗凍劑是降低冷凍食品品質(zhì)下降的有效途徑，而抗凍肽等新型抗凍劑取代傳統(tǒng)高糖、高鹽商業(yè)抗凍劑是隨著消費者對生活品質(zhì)及健康食品需求增長的必然趨勢。具有特定肽鏈長度和結(jié)構(gòu)域組成的食源性抗凍肽是解決天然抗凍蛋白研究和應(yīng)用受限問題的有效途徑。本文綜述了近年來基于食源性抗凍肽的研究進(jìn)展，以期為開發(fā)基于食品源的抗凍肽以及探索其在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供理論研究參考。