王春曉，唐佳代，吳鑫穎，周鴻翔，邱樹毅*

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

酒曲是以糧食為原料制成的糖化發(fā)酵劑，酒曲中微生物資源豐富，為發(fā)酵食品生產(chǎn)所需的酶提供穩(wěn)定的來(lái)源。傳統(tǒng)酒曲多采用自然接種和開放式培養(yǎng)的方式，品質(zhì)不易控制且存在食品安全隱患。將功能微生物應(yīng)用于釀酒與食品生產(chǎn)[1]，是相對(duì)于傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)更安全、高效和環(huán)保的技術(shù)方法。因此，酒曲中功能微生物的篩選和應(yīng)用成為了科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)共同關(guān)注的焦點(diǎn)。小曲是我國(guó)四大酒曲之一[2]，其應(yīng)用廣泛，但目前對(duì)于小曲及其中功能微生物的研究報(bào)道較少。本文著重對(duì)釀酒小曲中的功能微生物篩選、應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為功能微生物科學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 釀酒小曲簡(jiǎn)介

1.1 釀酒小曲的定義和分類

釀酒小曲多以大米、米糠、麩皮和谷類為原材料，部分加有中草藥[3]，是經(jīng)人工接種曲母或根霉、酵母菌培養(yǎng)而成的微生物制劑[4]，因曲塊體積小而得名。小曲被稱為白藥、酒餅、白曲、酒藥、藥曲、酒曲丸等。小曲主要用于生產(chǎn)甜米酒、黃酒、米香型白酒、清香型白酒和豉香型白酒[5]，具有很多不同種類（表1）：根據(jù)最終發(fā)酵成酒的類型，小曲可以分為白酒小曲、甜酒曲和黃酒小曲；根據(jù)不同的生產(chǎn)地區(qū)，小曲可分為廣東和廣西生產(chǎn)米香型白酒的小曲、貴州生產(chǎn)固態(tài)法白酒的藥小曲、江蘇和浙江生產(chǎn)黃酒及甜酒的酒藥等[3]。此外，根據(jù)成品曲形態(tài)、原料和中草藥添加等的不同，小曲還可分為其他不同類別（表1）。韓國(guó)的Nuruk和日本的Koji是類似于小曲的發(fā)酵劑，其中Nuruk是以未蒸煮大米、大麥、玉米和大豆等谷物為原料，接種霉菌、酵母和細(xì)菌制成的米酒發(fā)酵劑[6]，而Koji是將純種微生物接種于蒸熟的大米或大豆中制得的發(fā)酵劑[7]。

表1 釀酒小曲的分類Table 1 Categories of Xiaoqu

1.2 釀酒小曲的來(lái)源和發(fā)展歷史

古代酒曲的發(fā)展歷史時(shí)間軸如圖1所示。周代的《尚書·說(shuō)命下》中記載到“若作酒醴，爾惟曲蘗”，當(dāng)時(shí)用于釀酒的酒曲均為散曲；《楚辭》中有記載春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期“吳醴白蘗，再宿為醴”，其中的白蘗意為白米之曲，以稻米為原材料的小曲此時(shí)初步形成[8]；漢代人們先制散曲，在散曲基礎(chǔ)上制成塊狀曲[2]；北魏時(shí)期的《齊民要術(shù)》總結(jié)了9 種酒曲的制作工藝，尤其是利用“曲范”模具將曲塊加工成型，改進(jìn)了原來(lái)手工捏制成型的工藝。此外，北魏時(shí)期人們開始制作藥小曲；藥小曲制曲工藝在晉代發(fā)展成熟，人們將草藥汁加入由大米搗碎而成米粉中，制成卵狀放置于蓬蒿中一個(gè)月成曲；唐代為節(jié)省曲房空間，將散放酒曲改進(jìn)為堆放，稱為堆曲，并沿用至今；發(fā)展到宋朝時(shí)酒曲制作工藝已經(jīng)完善，人工接種技術(shù)開始應(yīng)用，而中草藥廣泛用于制作酒曲；到了元、明、清時(shí)期，更多的中草藥被應(yīng)用在小曲的制作中，使藥小曲的制作工藝得到了進(jìn)一步的發(fā)展[2]。

圖1 釀酒小曲發(fā)展時(shí)間軸Fig. 1 Developmental timeline of Xiaoqu

1.3 釀酒小曲的現(xiàn)代制作與應(yīng)用方式

相對(duì)于傳統(tǒng)工藝，釀酒小曲的現(xiàn)代制作工藝主要發(fā)展了麩皮制曲、純種制曲、加酶小曲和機(jī)械化制曲等方式，在提高糖化力和出酒率的同時(shí)降低了酒曲的使用量，節(jié)約了原料和人工成本，酒質(zhì)也得到了提高[9]。釀酒小曲發(fā)展到現(xiàn)在，與功能微生物的應(yīng)用是分不開的。一方面，功能微生物被制作成釀酒強(qiáng)化曲應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，強(qiáng)化曲是將原料浸泡或翻炒后粉碎過(guò)篩，接種功能性微生物或純種曲后加水拌勻并加工成型，經(jīng)培養(yǎng)干燥制成的微生物制劑；另一方面可直接在釀酒過(guò)程中加入功能微生物。然而，現(xiàn)代釀酒小曲中引入最多的功能微生物是起糖化作用的霉菌，對(duì)起酒化和酯化作用的功能酵母主要采用活性干酵母的形式引入，對(duì)影響風(fēng)味的功能細(xì)菌則少有引入，在小曲進(jìn)一步的發(fā)展中，尚需要對(duì)功能微生物的開發(fā)、工藝上合理應(yīng)用及制曲機(jī)械自動(dòng)化等方面開展更多深入的研究[9]。

在功能微生物的現(xiàn)代應(yīng)用過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)單一微生物曲釀造的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，但是風(fēng)味復(fù)雜性及特性不明顯，于是研究者開始探索多種功能微生物協(xié)同發(fā)酵的模式，如印度毛霉與米根霉協(xié)同發(fā)酵米酒[10]、純種根霉曲與釀酒酵母按一定比例制作的強(qiáng)化甜酒曲[11]、黑曲霉與米曲霉混合制曲[12]、純種釀酒酵母與傳統(tǒng)小曲協(xié)同糖化發(fā)酵[13]等。添加中草藥是制作釀酒小曲的一種傳統(tǒng)方法，近年來(lái)有研究者將功能微生物引入藥小曲，分析中草藥與功能微生物之間的相互影響（表2）。據(jù)報(bào)道，中草藥成分具有改善微生物營(yíng)養(yǎng)、抑制雜菌、抗氧化等功能[14]。微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等酶類能夠破壞中草藥的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，將其降解為微生物可利用的糖和氨基酸等小分子物質(zhì)[15]。研究表明，中草藥對(duì)酵母的生長(zhǎng)促進(jìn)作用較大，其次是黑曲霉和黃曲霉，對(duì)根霉起作用的中草藥材較少，而對(duì)細(xì)菌則主要起抑制作用[16]。

表2 中草藥對(duì)釀酒小曲及功能微生物的作用Table 2 Effect of Chinese herbal medicine on Xiaoqu and functional microbes in it

2 功能微生物的研究現(xiàn)狀

研究表明酒曲中的微生物主要為酵母菌、霉菌、細(xì)菌三大類[23]，通過(guò)糖化、酒化、產(chǎn)酯等作用影響成品酒的風(fēng)味特性。通常將具有高糖化率、高產(chǎn)酯類、低產(chǎn)高級(jí)醇、高產(chǎn)蛋白酶等能力的微生物稱為高活性菌株，即功能微生物。釀酒小曲中功能酵母菌主要有酒化、分泌芳香物質(zhì)的作用；功能霉菌主要有分解淀粉等物質(zhì)的作用；功能細(xì)菌主要有產(chǎn)生酸類物質(zhì)協(xié)調(diào)酒體的作用。研究者根據(jù)菌株的發(fā)酵性能，篩選出功能菌株應(yīng)用于發(fā)酵，使酒具有所需要的風(fēng)格。目前，釀酒小曲中功能微生物的認(rèn)識(shí)主要通過(guò)傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法分離獲取，近年來(lái)隨著組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，高通量測(cè)序技術(shù)被應(yīng)用于小曲中微生物的多樣性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了更豐富和復(fù)雜的微生物組成[24-25]，為更多功能微生物的工業(yè)應(yīng)用提供了參考。

2.1 功能酵母的研究進(jìn)展

釀酒小曲中的優(yōu)勢(shì)酵母菌為扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、漢遜酵母（Hansenulasp.）等[26]。酵母在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)進(jìn)行生長(zhǎng)和存活所必需的初級(jí)代謝，主要代謝產(chǎn)物為乙醇、乙醛和乙酸等，次級(jí)代謝并非生長(zhǎng)必需，主要產(chǎn)生高級(jí)醇、酯類、硫醇和萜烯類化合物等[27-28]。

酵母菌的酒化能力直接影響酒質(zhì)和發(fā)酵效率，因此是功能酵母篩選的主要關(guān)注點(diǎn)之一。高產(chǎn)酒酵母多采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑培養(yǎng)基鑒別法來(lái)篩選[29]，該方法通過(guò)肉眼觀察菌落顏色深淺可初步判斷其酒化能力，但不利于不同研究報(bào)道之間的對(duì)比性評(píng)價(jià)。研究者還可采用酒精計(jì)法或氣相色譜法等檢測(cè)乙醇含量，定量化的研究結(jié)果有利于所篩選高產(chǎn)酒酵母的功能評(píng)價(jià)和工業(yè)化應(yīng)用。目前已報(bào)道的高產(chǎn)酒酵母如表3所示（未檢測(cè)乙醇產(chǎn)量的研究不在其列），釀酒酵母作為主要酒化酵母，具有較強(qiáng)的乙醇產(chǎn)生能力，在發(fā)酵過(guò)程中主要通過(guò)糖酵解途徑和乙醛途徑產(chǎn)生乙醇（圖2）。伍保龍等[30]從米酒酒曲中篩選到一株產(chǎn)酒能力強(qiáng)的釀酒酵母5-1Y，可將230 g/L葡萄糖溶液幾乎完全發(fā)酵（糖利用率高達(dá)99.9%）產(chǎn)生13.16%酒精度（乙醇體積分?jǐn)?shù)）。

酵母菌的產(chǎn)香能力對(duì)不同酒的風(fēng)味特征形成起關(guān)鍵作用，作為不可忽視的風(fēng)味物質(zhì)，高級(jí)醇和酯類的產(chǎn)生主要由酵母生長(zhǎng)不必需的次級(jí)代謝產(chǎn)生，其代謝途徑如圖2所示。

2.1.1 高級(jí)醇產(chǎn)生途徑

圖2 發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母產(chǎn)生乙醇、高級(jí)醇和酯類的代謝途徑[28,31]Fig. 2 Metabolic pathways of ethanol, higher alcohols and esters in S. cerevisiae during fermentation[28,31]

酵母在發(fā)酵過(guò)程可通過(guò)2 種途徑產(chǎn)生高級(jí)醇——氨基酸分解代謝途徑即Ehrlich途徑[31]（圖2中紅色箭頭）和糖代謝合成途徑（圖2中藍(lán)色箭頭）。Ehrlich途徑是發(fā)酵原料中的7 種不同氨基酸（圖2）在轉(zhuǎn)氨酶的催化下通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用合成相應(yīng)的α-酮酸，α-酮酸脫羧形成醛，醛在脫氫酶的作用下進(jìn)一步還原為相應(yīng)高級(jí)醇。參與Ehrlich途徑的酶主要包含氨基酸滲透酶（參與從原料中攝取亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）[32-33]、氨基酸轉(zhuǎn)移酶（在線粒體和溶膠上起到催化氨基從氨基酸轉(zhuǎn)移至α-酮酸的作用）[34]、脫羧酶（將α-酮酸脫羧形成相應(yīng)的醛）和乙醇脫氫酶（將相應(yīng)的醛還原為高級(jí)醇）[35-36]。研究證實(shí)，氨基酸通過(guò)Ehrlich途徑產(chǎn)生高級(jí)醇的每一步反應(yīng)都存在各種同工酶，主要是由于環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件的不同引起的，因此給相關(guān)酶身份和編碼基因的鑒定提出了難題。如圖2所示，多個(gè)基因參與Ehrlich途徑相關(guān)酶的編碼，但人們對(duì)這些基因所編碼酶的認(rèn)知尚不完全[31,37]。在氨基酸缺乏的情況下，Ehrlich途徑無(wú)法進(jìn)行，此時(shí)酵母可通過(guò)糖代謝合成途徑產(chǎn)生高級(jí)醇：發(fā)酵原料中的葡萄糖通過(guò)糖酵解分解為丙酮酸，再進(jìn)一步合成α-酮酸，或通過(guò)中間產(chǎn)物直接合成α-酮酸，α-酮酸經(jīng)過(guò)與Ehrlich途徑相同的脫羧和還原反應(yīng)形成高級(jí)醇。

高級(jí)醇或稱雜醇油是指碳原子數(shù)超過(guò)2的一元醇，主要包括正丙醇、異戊醇、異丁醇、活性戊醇、苯乙醇、酪醇、色醇和甲硫醇等[31,38]。高級(jí)醇是酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)（如低濃度的苯乙醇呈花香風(fēng)味[28]），但其含量過(guò)多會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害[39]，高級(jí)醇中己醇被列在有害物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中[40]，異戊醇和異丁醇對(duì)人體毒性最大，酒精飲料中高級(jí)醇總量應(yīng)小于10 g/L[38,41-42]。研究者們主要通過(guò)單倍體制備、菌種誘變、從自然界分離篩選等方式獲取低產(chǎn)高級(jí)醇酵母，截至目前獲取的低產(chǎn)高級(jí)醇酵母全部為釀酒酵母（表3）。郝欣等[43]篩選了一株高級(jí)醇產(chǎn)量為340.906 mg/L的釀酒酵母AY-15，并進(jìn)一步通過(guò)分子育種獲得高級(jí)醇產(chǎn)量更低的單倍體α-22（比親本AY-15低12.46%）。王國(guó)正等[44]對(duì)篩選出的低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母菌株CF4進(jìn)行常溫常壓等離子體誘變，獲得了使正丙醇、異丁醇和異戊醇含量分別降低20%、19.4%和21.5%的誘變菌株釀酒酵母ARTP5。值得注意的是，使用不同的培養(yǎng)基會(huì)影響風(fēng)味物質(zhì)的形成[45-46]，因此表3列出的功能酵母相互之間的高級(jí)醇產(chǎn)量不具有可比性。

2.1.2 酯類產(chǎn)生途徑

高級(jí)醇和乙醇是乙酸酯類化合物的前體物質(zhì)[47]，原料中的氨基酸/葡萄糖經(jīng)過(guò)Ehrlich途徑/糖代謝合成途徑產(chǎn)生高級(jí)醇；葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解途徑和乙醛途徑產(chǎn)生乙醇。作為前體物質(zhì)，高級(jí)醇或乙醇都可進(jìn)一步與乙酰輔酶A通過(guò)合成反應(yīng)產(chǎn)生乙酸酯類化合物，前者生成乙酸高級(jí)酯（如乙酸異戊酯、2-甲基丁基乙酸酯和乙酸苯乙酯等）而后者生成乙酸乙酯[28]。如圖2所示，該反應(yīng)由ATF1和ATF2基因所編碼的乙醇乙?；D(zhuǎn)移酶催化合成[48-49]。此外，原料中的脂質(zhì)通過(guò)代謝可產(chǎn)生中鏈脂肪酸，被輔酶A激活后可進(jìn)一步與乙醇反應(yīng)合成乙酯類化合物（丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等）[28]。該反應(yīng)由EEB1和EHT1編碼的?；D(zhuǎn)移酶所催化（圖2）[50]。

發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙酸酯類化合物主要呈現(xiàn)香蕉、蘋果等香味特征，而乙酯類化合物呈現(xiàn)蘋果、草莓、梨和茴香等香味特征[28]。發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙醇在含量和活性兩方面均高于高級(jí)醇，因此乙酸乙酯是發(fā)酵過(guò)程中最常見(jiàn)的乙酸酯類化合物[28]，也是小曲酒的主體香成分之一[46,51]。由于酯類物質(zhì)對(duì)酒體風(fēng)味的重要作用，研究者對(duì)高產(chǎn)酯酵母十分關(guān)注，研究稱漢遜酵母屬、假絲酵母屬、產(chǎn)朊酵母屬和扣囊覆膜酵母等是酒中酯香的主要產(chǎn)生菌[52]，其中扣囊覆膜酵母還具有較強(qiáng)的淀粉酶活性[53]。目前通過(guò)自然分離和誘變育種，研究者獲取的高產(chǎn)酯功能酵母如表3所示。李銳利[54]從白酒小曲中篩選出一株異常漢遜氏酵母，并將其應(yīng)用到小曲酒的生產(chǎn)中，使乙酸乙酯含量提高了49.8%。王鵬昊等[55]從小曲中篩選到一株產(chǎn)酯量達(dá)2.684 g/L的異常威克漢姆酵母，其乙酸乙酯產(chǎn)量為2.481 g/L。

功能酵母菌可以同時(shí)具有低產(chǎn)高級(jí)醇和高產(chǎn)酯/酒的功能特征，目前獲取的酵母菌多為釀酒酵母（表3）。王勇[29]從酒曲中分離得到了2 株高產(chǎn)乙酸乙酯、低產(chǎn)高級(jí)醇的釀酒酵母Y006和Y008，并分別制成強(qiáng)化曲應(yīng)用在釀酒生產(chǎn)中，證明兩者均有降低高級(jí)醇含量和提高乙酸乙酯含量及出酒率的作用。李維等[56-57]從釀酒酵母AY15的單倍體重組菌株中篩選低產(chǎn)高級(jí)醇和高產(chǎn)酯/酒的單倍體，并進(jìn)一步雜交形成新的二倍體菌株AY15-BAT2＋ATF1和AY15-IAH1＋ATF1，2 株重組雜交菌在發(fā)酵高粱糖化液時(shí)同時(shí)表現(xiàn)了低產(chǎn)高級(jí)醇和高產(chǎn)酯的功能特征。

表3篩選的功能酵母大多已在實(shí)驗(yàn)室或中試條件下通過(guò)直接接種加入發(fā)酵醪的方式進(jìn)行應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明功能酵母可以改善酒質(zhì)或酒的風(fēng)味，具有一定的應(yīng)用價(jià)值[9,58]。楊強(qiáng)等[59]將功能酵母制備成麩皮種并按一定比例加入酒曲中，有效改善了小曲白酒的風(fēng)味。魏浩林等[11]將功能酵母與純種根霉曲按比例混合復(fù)配制成強(qiáng)化曲，提高了酒曲的發(fā)酵力和酯化力，為制作新型酒曲提供了思路。表3所示的21 株功能酵母中只有5 株分離自釀酒小曲，因此需進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)釀酒小曲功能酵母的研究和工業(yè)應(yīng)用。

2.2 功能霉菌的研究進(jìn)展

功能霉菌在發(fā)酵過(guò)程中主要起糖化作用，即分離水解原料中的淀粉等大分子物質(zhì)為葡萄糖。在厭氧條件下，一些霉菌還可進(jìn)一步利用糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇（酒化作用）。除淀粉酶之外，功能霉菌還能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、酒化酶和單寧酶等[77]，在食品、釀造以及生物工程等產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮重要作用（表3）。

表3 已篩選獲取的功能微生物種類Table 3 Categories of functional microbes that have been obtained in the literature

2.2.1 淀粉酶

霉菌產(chǎn)生的淀粉酶有液化淀粉酶、糖化酶和葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等。液化淀粉酶（α-淀粉酶）主要由青霉和曲霉產(chǎn)生，能水解淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，水解產(chǎn)物為短鏈糊精、寡糖、麥芽糖和葡萄糖，從而達(dá)到降低淀粉黏度（液化）的目的。糖化酶（α-1,4-葡萄糖水解酶）主要由根霉和曲霉產(chǎn)生，能將淀粉結(jié)構(gòu)中的α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵切斷，使絕大部分淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖[78]，為進(jìn)一步發(fā)酵提供原料。酒曲中功能霉菌主要通過(guò)自然分離和菌種誘變的方式獲取，其中高產(chǎn)淀粉酶菌株是目前主要的關(guān)注點(diǎn)（表3）。李江華等[67]從黃酒酒曲和酒藥中分離到一株米曲霉A019，所產(chǎn)α-淀粉酶活力達(dá)410 U/g曲。

2.2.2 蛋白酶

蛋白酶主要由青霉和曲霉產(chǎn)生，分為堿性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶。蛋白酶將原料中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸，氨基酸可進(jìn)一步被酵母代謝，形成酒中重要的風(fēng)味化合物——高級(jí)醇或酯。氨基酸還能在原料蒸煮過(guò)程中與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[79]。酸性蛋白酶通過(guò)水解蛋白質(zhì)，將一些與蛋白緊密結(jié)合的淀粉釋放出來(lái)，從而為糖化發(fā)酵創(chuàng)造有利條件，因此高產(chǎn)酸性蛋白酶的功能霉菌也是目前的研究熱點(diǎn)之一（表3）。尹永祺[69]從黃酒酒曲中分離到一株米曲霉DYT-30，不僅高產(chǎn)α-淀粉酶（68.6 U/g曲）和糖化酶（1 678.0 U/g曲），而且所產(chǎn)酸性蛋白酶活力達(dá)839.9 U/g曲。

2.2.3 其他酶類

一株霉菌可能產(chǎn)生多種酶類。研究人員曾從黃酒麥曲中分離到一株黑曲霉CF7，可分泌纖維素酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶和木聚糖酶[12]。除淀粉酶和蛋白酶外，霉菌分泌的其他酶類很多也對(duì)釀酒過(guò)程有益：纖維素酶主要由青霉和曲霉產(chǎn)生，纖維素酶的添加可以提高出酒率、減少高級(jí)醇含量、增加酯和酸含量[80]；根霉產(chǎn)生的酒化酶，在發(fā)酵過(guò)程中糖化的同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，提高淀粉利用率[78]；一些曲霉和根霉可以產(chǎn)生單寧酶[81]，單寧酶能夠?qū)螌幩鉃闆](méi)食子酸和葡萄糖，沒(méi)食子酸是一種具有抗氧化性的多酚，可促進(jìn)酵母菌的生長(zhǎng)，葡萄糖則被微生物所利用產(chǎn)生乙醇[81]；曲霉產(chǎn)生的酸性羧肽酶能夠分解多肽，增加酵母的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[82]；毛霉、根霉和曲霉產(chǎn)生的脂肪酶能將油脂水解為脂肪酸和甘油，并進(jìn)一步通過(guò)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生醇、酸和醛類物質(zhì)，成為合成酯類的前體物質(zhì)[83]。

表3所示的11 株功能霉菌中有8 株分離自釀酒小曲，說(shuō)明人們對(duì)起糖化作用的功能霉菌的關(guān)注度高于功能酵母，然而，目前功能霉菌的研究多集中在淀粉酶和蛋白酶，對(duì)產(chǎn)其他酶類的功能霉菌分離篩選和研究相對(duì)較少（表3）。釀酒小曲中分離的功能霉菌大多被制備成純種曲或進(jìn)一步與其他純種霉菌曲混合制成復(fù)合酒曲，以在工業(yè)生產(chǎn)中提高糖化力、改善酒質(zhì)[10,69]。

2.3 功能細(xì)菌的研究進(jìn)展

酒曲中的酵母和霉菌在發(fā)酵初期存在一段生長(zhǎng)延遲期，此階段細(xì)菌起著至關(guān)重要的作用：為發(fā)酵提供酸性的環(huán)境；產(chǎn)生蛋白酶、果膠酶、脂肪酶、糖化酶和纖維素酶等酶類；酯化、促進(jìn)美拉德反應(yīng)和產(chǎn)生吡嗪類風(fēng)味物質(zhì)[74]。酒曲中功能細(xì)菌的研究如表3所示，目前已報(bào)道的功能細(xì)菌以芽孢桿菌居多，芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶能夠降解原料中的大分子蛋白質(zhì)，產(chǎn)生的酸性蛋白酶和淀粉酶可促進(jìn)酒曲的糖化和液化，還可產(chǎn)生吡嗪類風(fēng)味物質(zhì)[74]。騰軍偉等[1]從江米酒酒曲中分離的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1具有分泌凝乳酶的功能，凝乳活力達(dá)431.53 SU/mL。但是，康憲[84]指出芽孢桿菌對(duì)甜酒曲中的根霉菌菌絲有明顯的抑制作用。故在利用多種微生物協(xié)同發(fā)酵制作復(fù)合酒曲時(shí)，需考慮功能細(xì)菌相對(duì)功能酵母和霉菌的接種量，及其與其他微生物共接種時(shí)是否可協(xié)同發(fā)揮不同微生物的功能。

目前關(guān)于小曲中功能細(xì)菌的研究報(bào)道較少，表3所示的9 株功能細(xì)菌中只有1 株分離自釀酒小曲，要開發(fā)釀酒小曲中的功能細(xì)菌，需對(duì)不同釀酒小曲中的細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)性研究。由于功能細(xì)菌主要功能為產(chǎn)酸，無(wú)法同時(shí)滿足釀酒所需的糖化和酒化功能，因此需要與功能霉菌和酵母菌協(xié)同使用。目前鮮有文獻(xiàn)對(duì)釀酒小曲中篩選的功能細(xì)菌進(jìn)行純種發(fā)酵研究，大多在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)直接加入的方式研究功能細(xì)菌在增加風(fēng)味的同時(shí)是否會(huì)抑制霉菌糖化、酵母酒化、酯化及生長(zhǎng)，如研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在與高產(chǎn)酯酵母共同使用時(shí)產(chǎn)生相互抑制的現(xiàn)象[85]。總之，目前對(duì)釀酒小曲中功能細(xì)菌的研究有限，需進(jìn)一步開展相關(guān)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，拓展功能細(xì)菌的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，釀酒小曲中功能微生物的研究取得了一些進(jìn)展，但相對(duì)于大曲的研究仍存在一些不足：1）釀酒小曲中微生物的多樣性研究受傳統(tǒng)分離篩選方法的局限，目前關(guān)于小曲微生物資源的研究不夠全面。在今后的研究中，需結(jié)合微生物組學(xué)技術(shù)對(duì)釀酒小曲中豐富的微生物資源進(jìn)行全面挖掘[24-25]；2）釀酒小曲中研究較多的功能微生物是起糖化作用的霉菌，對(duì)分泌其他酶類的霉菌、起酒化和酯化作用的功能酵母及影響風(fēng)味的功能細(xì)菌少有報(bào)道。今后需在釀酒小曲中豐富微生物資源解讀的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)對(duì)功能微生物的深入代謝研究和開發(fā)。也需加強(qiáng)對(duì)所開發(fā)的功能微生物的應(yīng)用研究，目前功能霉菌主要通過(guò)制成純種曲或復(fù)合強(qiáng)化曲的方式進(jìn)行應(yīng)用實(shí)驗(yàn)[10,69]，功能酵母主要采用直接接種或制成復(fù)合強(qiáng)化曲的方式進(jìn)行應(yīng)用實(shí)驗(yàn)[9,11,58-59]，而對(duì)于功能細(xì)菌的應(yīng)用研究尚比較局限；3）釀酒小曲中不同種類功能微生物在發(fā)酵過(guò)程中的協(xié)同、拮抗和抑制作用是工業(yè)應(yīng)用中不容忽視的問(wèn)題，如釀酒酵母與乳酸菌共發(fā)酵產(chǎn)生的促進(jìn)和抑制作用[85]、黑曲霉與米曲霉混合制曲對(duì)酶活力提高的協(xié)同作用[12]等，但目前關(guān)于功能微生物間相互影響機(jī)制的研究尚不多見(jiàn)[46]。Zhu Jing等[42]報(bào)道稱，2 株地霉屬菌株可降低成品白酒中高級(jí)醇含量并同時(shí)增加酯類含量，為功能微生物的創(chuàng)新性應(yīng)用提供了新的思路。今后需在對(duì)功能微生物進(jìn)行應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的同時(shí)研究不同種類微生物的相互作用，思考合理的應(yīng)用方式，使霉菌、酵母和細(xì)菌能協(xié)同發(fā)揮作用。

隨著食品生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的功能微生物正在改變釀酒方式，釀酒小曲中功能微生物的研究與開發(fā)具有很好的應(yīng)用前景，需要得到更多的關(guān)注。高通量測(cè)序技術(shù)、基因編輯與重組技術(shù)和宏基因組等[86-88]現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，能夠幫助人們快速了解釀酒小曲中微生物的多樣性，促進(jìn)更多功能微生物的挖掘，有利于分析與應(yīng)用特定功能微生物的功能基因。未來(lái)，宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)的綜合利用可以幫助人們了解功能微生物間的相互作用，為在發(fā)酵過(guò)程中更好地應(yīng)用釀酒小曲中的功能微生物產(chǎn)生高品質(zhì)代謝產(chǎn)物提供基礎(chǔ)。