黃鑫，唐紅梅，唐青蓮，劉陽，*，鄧靜

（1.四川旅游學(xué)院，四川成都610100；2.四川理工學(xué)院，四川自貢643000）

大頭菜又名根用芥菜、辣疙瘩、諸葛菜[1]，廣泛種植于中國西部地區(qū)。它富含維生素、膳食纖維和大量的微量元素、糖類、蛋白質(zhì)等[2]，可促進結(jié)腸蠕動，防止便秘[3]。大頭菜皮厚，肉質(zhì)致密堅實，水分少且具有強烈的辛辣味和少許苦味，不宜生吃，因此，多通過腌制進行加工食用[4]。腌制大頭菜一般經(jīng)選料、初曬、拌料、復(fù)曬、加料、密封和腌制等工序加工而成，經(jīng)60 d～90 d發(fā)酵后成熟[5]。大頭菜經(jīng)腌制加工后，組織脆爽、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富，深受消費者歡迎[6]。目前，對大頭菜的研究主要集中于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[7]、工藝[8]、乳酸菌[9]等方面，但對發(fā)酵過程中生香酵母的研究較少。

生香酵母是一類能夠代謝產(chǎn)生香氣成分的酵母菌的總稱，發(fā)酵過程中除參與醛縮醇類、含硫化合物等香氣成分的生成外，還一定程度地參與氨基酸和有機酸類的生成，因此能顯著增加食品的香氣成分[10]。目前，對生香酵母的研究應(yīng)用較多，但主要集中在酒類[11]、調(diào)味品[12]、面制品[13]及其特性研究上。Jie Feng 等[14]從醬油中分離出一株嗜鹽生香酵母（Candida etchellsii），利用高效液相技術(shù)與氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對酵母產(chǎn)生的有機酸、氨基酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行了分析。A Cadière 等[15]采用一種以葡萄糖酸酯為唯一碳源的自適應(yīng)進化策略，獲得了具有改良特性的葡萄酒酵母。

本試驗從腌制大頭菜的發(fā)酵液中篩選生香酵母，通過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗及18S rDNA 對菌株進行分類鑒定，為生香酵母在大頭菜中的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

腌制大頭菜發(fā)酵液：四川內(nèi)江威寶食品有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

SHP0201147047 型電子分析天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；BH200 型光學(xué)顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司；SW-CJ-IF 型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SM530C 型立式壓力蒸汽滅菌鍋：成都盛德先華科貿(mào)有限公司；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；QYC-2102C 型搖床：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；201-3AB 型電熱恒溫干燥箱：余姚市東方電工儀器廠；S1000 型PCR 擴增儀：美國BIO-RAD公司；DY-6C 型電泳儀：北京市六一儀器廠；Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD 公司。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂、孟加拉紅、氯霉素、乙醇、酵母膏、瓊脂粉、亞甲基藍、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣、硝酸鉀、尿素、溴甲基酚紫、酚紅、氫氧化鉀、品紅、異戊醇、乙醇、溴化乙錠（EB）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.4 培養(yǎng)基

孟加拉紅固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，瓊脂2%，葡萄糖1%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，1/3000 孟加拉紅溶液10 %，補足蒸餾水，分裝后121 ℃滅菌20 min，氯霉素0.01%，用少量乙醇將氯霉素溶解，加入已滅菌的45 ℃～50 ℃培養(yǎng)基中。

YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，酵母膏0.1%，自然pH 值。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，自然pH 值。

碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母膏0.02%，磷酸二氫鉀0.1%，氯化鈣0.01%，硫酸銨0.5%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.01%，糖或其它碳源0.5%，自然pH 值。

氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，酵母膏0.02%，氮源0.5%，葡萄糖2%，自然pH 值。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離

取腌制大頭菜發(fā)酵液1.0 mL 注入9 mL 無菌水中，制成 1∶10 的樣品勻液。再吸取 1 mL 1∶10 的樣品勻液注入9 mL 無菌水中，制成1∶100 的樣品勻液。按上述操作制備10 倍系列稀釋樣品勻液。分別吸取各稀釋度的樣品勻液0.1 mL，無菌環(huán)境下在孟加拉紅培養(yǎng)基上涂布分離，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取與酵母菌菌落形態(tài)相符的單個菌落再于PDA 與YPD 培養(yǎng)基上劃線，純化2 次，觀察菌落形態(tài)，確定為單菌落后將所分離的酵母菌轉(zhuǎn)接于PDA 和YPD 試管斜面培養(yǎng)基上，于4 ℃生化培養(yǎng)箱保存[16]。

1.2.2 生香酵母的篩選

挑選純化培養(yǎng)后的單菌落點種于YPD 培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，仔細觀察菌株形態(tài)并進行記錄，并分別挑取YPD 培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基上的單菌落接種于50 mL YPD 液體培養(yǎng)基和50 mL PDA液體培養(yǎng)基上，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h～72 h，采用嗅聞法判斷產(chǎn)香情況[17]。

1.2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

參照《真菌鑒定手冊》[18]以及《酵母菌的特征與鑒定手冊》[19]對生香酵母進行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，初步確定其分類地位。

1.2.3.1 菌落形態(tài)觀察

按無菌操作將各個菌株點種于YPD 培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基以及孟加拉紅培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度等，作好記錄[20]。

1.2.3.2 細胞形態(tài)觀察

取潔凈載玻片，加入0.1 mL 美藍染液，接種環(huán)挑取少量菌體在載玻片上涂勻，染色15 min～20 min，用流水沖洗載玻片至流出水無色，吸水紙吸干殘留水分，晾干。于100 倍油鏡下觀察，形態(tài)、大小、有無孢子等，記錄并拍照。

1.2.4 生理生化試驗鑒定

通過糖發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、分解尿素試驗對已分離出的生香微生物進行鑒定，從而確定其生理生化特性，初步判斷菌株的種屬。

1.2.5 菌株分子鑒定

18S rDNA 是真核生物中編碼的核糖體小亞基的DNA 序列，其為微生物種群的區(qū)分、鑒定以及生物進化關(guān)系的研究提供了極大的可能[21]。將待測菌株接種于 YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 48 h，過濾，收集菌體，采用十二烷基硫酸鈉-十六烷基三甲基溴化銨方法（SDS-CTAB）提取菌株的總DNA，采用真菌 18S rDNA 通 用 引 物 對 NS1 和 NS8 （NS1：5′ -GTAGTCATATGCTTGTCTC -3′；NS8：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′）對菌株進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增[22]。50 μL PCR 反應(yīng)體系為：50 μg 模板、5 μmoL 正反引物、50 μmol/L dNTP、5 μL 10×PCR 緩沖物（MgCl2）、2.5 U E×Taq DNA 聚合酶，無菌純水補齊到50 μL。PCR 擴增條件[17]：94 ℃預(yù)變性 10 min，94 ℃變性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 30 個循環(huán)，最后72 ℃補平7 min，終止溫度4 ℃。

將PCR 擴增產(chǎn)物送至檢測機構(gòu)進行測序。利用NCBI 對測得序列進行BLAST 同源性比對，并利用MEGA 7.0 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 生香酵母的篩選

經(jīng)1.2.1 篩選得9 株菌，經(jīng)過YPD、PDA 培養(yǎng)純化后，編號為 J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9。為進一步篩選，對9 株菌的生香能力進行測試，結(jié)果見表1。

在 PDA 培養(yǎng)基中，J1、J5、J7、J9 產(chǎn)生的香氣較強，J3、J8 產(chǎn)生的香氣一般，J2、J6 產(chǎn)生的香氣較弱，J4 則不產(chǎn)香；在 YPD 培養(yǎng)基中，J5 產(chǎn)生的香氣較強，J1、J3、J7、J8、J9 產(chǎn)生的香氣一般，J6 產(chǎn)生的香氣較弱，J2 不產(chǎn)香。通過嗅聞法，初步選定 J1、J3、J5、J7、J8、J9 這 6株生香能力較強的菌株進行下一步鑒定。

表1 9 株菌生香能力研究Table 1 The ability to study 9 strains of aroma-producing yeast

2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將生香能力較強的6 株菌點種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)；利用美藍染色，于100倍油鏡下觀察細胞形態(tài)，結(jié)果見圖1。根據(jù)《真菌鑒定手冊》與《酵母菌的特征與鑒定手冊》對各菌株的形態(tài)進行描述，結(jié)果見表2。

2.3 生理生化鑒定

對已純化培養(yǎng)后的6 種單菌株進行生理生化試驗，得到試驗結(jié)果如表3，根據(jù)試驗結(jié)果，確定其生理特征，從而得出菌株的種類。

由表3 可知，J1 可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，可以同化乙醇、可溶性淀粉、硝酸鉀、硫酸銨，能夠分解尿素；J3 可以發(fā)酵葡糖、蔗糖、麥芽糖，可以同化乙醇、可溶性淀粉、硝酸鉀、硫酸銨，能夠分解尿素；J5 可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，可以同化乙醇、硫酸銨；J7 可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，可以同化乙醇、可溶性淀粉、硝酸鉀、硫酸銨，可以分解尿素；J8 可以發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，可以同化乙醇、可溶性淀粉、硫酸銨；J9 可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，可以同化乙醇、硫酸銨。

圖1 菌株的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)Fig.1 The colony morphology and cell morpholopy of strains

表2 菌株形態(tài)描述Table 2 The description of morphology of strains

表3 生理生化試驗結(jié)果Table 3 The results of physiological and biochemical test

根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》、《真菌鑒定手冊》并結(jié)合圖 1，表2、3，可以初步判斷 J1、J3、J7 為奧默柯達畢赤酵母屬，J5、J9 為畢赤酵母屬，J8 為假絲酵母屬。

2.4 菌株分子鑒定

將篩選得出的6 株生香酵母進行18S rDNA 基因序列測定，各菌株基因序列檢測結(jié)果見表4。使用DNASTAR 以及CHROMAS 峰圖將相同屬菌株基因序列進行比對，得出 J1、J3、J7 屬于同一菌種，J5、J9 屬于同一菌種，J8 為一個菌種。

將 J1、J5、J8 的 18S rDNA 基因序列輸入美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）中進行核苷酸序列比對檢索（BLAST）比對，選取同源性較高的模式菌株運用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，且Bootstrap對進化樹進行1 000 次可信度分析，見圖2。具體鑒定結(jié)果見表5。

由表5、圖2 可以看出，J1 與奧默柯達酵母（Ko－damaea ohmeri）（KY684065.1）處于同一分支上，且同源性為100%，因此J1 鑒定為Kodamaea ohmeri。J5 與季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）（MG846137.1）處于同一分支，同源性為99%，最終確定J5 為 Meyerozyma guilliermondii。J8 與熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）（MG599246.1）處于同一分支，同源性僅為87%，可能是新發(fā)現(xiàn)的Candidatropicalis。

表4 菌株18S rDNA 基因序列Table 4 The genetic sequence of 18S rDNA

表5 18S rDNA 菌種鑒定Table 5 The identification of 18S rDNA strain

圖2 菌株18S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of 3 kinds of fungi based on 18S rDNA sequence

3 結(jié)論

從腌制大頭菜的發(fā)酵液中分離出9 株酵母菌，經(jīng)過產(chǎn)香特性的比較選取產(chǎn)香能力較強6 株菌進行形態(tài)學(xué)、生理生化試驗及18S rDNA 鑒定。結(jié)果表明：J1、J3、J7 屬于同種菌株，為奧默柯達酵母（Kodamaea ohmeri）；J5、J9 屬于同種菌株，為季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）；J8 為熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）。目前，對于大頭菜發(fā)酵過程中生香酵母的研究還處于起步階段，生香酵母的篩選鑒定、生香特性、耐鹽機理的研究、菌劑的制備等領(lǐng)域均未見文獻報道。因此，本研究結(jié)果為大頭菜中生香酵母的進一步研究提供參考依據(jù)。