馬 歐，郭美仙，何正春，楊毅雯

云南松松塔正丁醇提取物對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的影響

馬 歐1，郭美仙2，何正春2，*楊毅雯2

(1. 昭通市中醫(yī)醫(yī)院，云南，昭通 657000；2. 大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南，大理 671000)

研究云南松松塔正丁醇提取物對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的作用。通過(guò)制備大鼠離體子宮標(biāo)本，觀察云南松松塔正丁醇提取物對(duì)大鼠離體子宮平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)，催產(chǎn)素及乙酰膽堿誘發(fā)收縮活動(dòng)的影響。云南松松塔正丁醇提取物可使正常大鼠自發(fā)收縮和催產(chǎn)素及乙酰膽堿誘發(fā)收縮的頻率減慢、張力減小、活動(dòng)力減弱。云南松松塔正丁醇提取物對(duì)大鼠離體子宮平滑肌的收縮活動(dòng)具有抑制作用，其機(jī)制可能跟阻斷催產(chǎn)素受體和M受體有關(guān)。

云南松松塔；大鼠離體子宮；催產(chǎn)素；乙酰膽堿

云南松(Franch.）為松科松屬，屬裸子植物門[1-2]，松塔是其球果?！侗静菥V目》中記載松塔具有祛痰、止咳平喘、祛風(fēng)、潤(rùn)腸、安神等功效。隨著現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)松塔中含有多糖、木質(zhì)素、二萜、黃酮、揮發(fā)油[3-8]等多種化學(xué)成分。此外，松塔還具有抗病毒[9]、抗氧化[10]、免疫增強(qiáng)[11]和抗腫瘤[12]等作用。郭美仙等人[13]研究發(fā)現(xiàn)云南松松塔乙醇浸膏，石油醚部位和氯仿部位對(duì)靜息離體氣管有舒張作用，然而云南松松塔對(duì)子宮平滑肌的作用至今尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了云南松松塔正丁醇提取物對(duì)大鼠離體子宮平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)和催產(chǎn)素及乙酰膽堿誘發(fā)收縮活動(dòng)的影響，以期闡明松塔正丁醇提取物對(duì)子宮平滑肌的藥理作用，為今后對(duì)于云南松松塔的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

催產(chǎn)素（蚌埠市宏業(yè)生化制藥廠，批號(hào)：060924）；乙酰膽堿（上海麗珠東風(fēng)生物制藥，批號(hào)：150321）。

1.2 動(dòng)物

SD雌性未孕大鼠，清潔級(jí)，體重250-300 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)2011-0004。

1.3 儀器

BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，HW-400恒溫平滑肌槽（成都泰盟電子有限公司）；張力換能器（航天工程醫(yī)學(xué)工程研究所）。

2 方法

2.1 樣品提取

云南松松塔采自云南省大理白族自治州蒼山，由大理大學(xué)生藥學(xué)教研室張德全副教授鑒定為松科松屬植物云南松 (Franch.) 的松塔 ( Pine cone )。取云南松松塔干燥粉碎10 kg，用95%的乙醇冷浸提?。?4 h×3次），合并提取液，減壓濃縮回收溶劑。濃縮得到的乙醇浸膏加適量的蒸餾水混懸，用正丁醇進(jìn)行萃取。然后對(duì)萃取得到的正丁醇部分進(jìn)行減壓濃縮回收溶劑，即得正丁醇部位51.6 g，冷凍干燥備用。

2.2 樣品配置

稱取云南松松塔的正丁醇提取物4.8 g置于燒杯中，然后取一定量的蒸餾水于燒杯中溶解（超聲溶解），接著轉(zhuǎn)移至量筒中，定容至50 mL即得到96.0 mg/mL混懸液，然后依次倍比稀釋，得到48.0、24.0、12.0、6.0、3.0、1.5 mg/mL混懸液 ,備用[13]。

2.3 營(yíng)養(yǎng)液配置

按參考文獻(xiàn)的方法配置戴雅隆氏液[14]。

2.4 標(biāo)本制備

實(shí)驗(yàn)前48 h，取大鼠肌肉注射0.2%己烯雌酚0.2 mL/100 g，以提高子宮對(duì)藥物的敏感性。實(shí)驗(yàn)時(shí)，頸椎脫臼法處死大鼠，立即取出子宮，放入盛有冷營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，剪去子宮周圍的組織，備用。剪取1.0~1.5 cm長(zhǎng)的子宮體作為標(biāo)本，在標(biāo)本兩端穿線，一端固定于通氣鉤上，另一端與張力換能器相連，置于盛有20.0 mL營(yíng)養(yǎng)液的標(biāo)本槽中，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)負(fù)荷1~1.5 g，溫度（37 ± 0.5）℃，通氧氣1~2個(gè)氣泡/ s，平衡30 min，待標(biāo)本穩(wěn)定后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)[15-16]。

2.5 云南松松塔正丁醇提取物對(duì)大鼠離體子宮平滑肌張力的影響

2.5.1 對(duì)離體子宮平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)的影響

標(biāo)本穩(wěn)定后，記錄6 min正常收縮曲線，加入0.2 mL蒸餾水（營(yíng)養(yǎng)液19.8 mL），記錄6 min收縮曲線；換洗4次，待曲線回復(fù)正常后，加入1.5 mg/mL云南松松塔正丁醇提物混懸液0.2 mL（營(yíng)養(yǎng)液19.8 mL），記錄6 min收縮曲線；換洗4次，待曲線回復(fù)正常后，依次分別從低濃度到高濃度加入不同濃度樣品（操作同前），記錄6 min收縮曲線。觀察并分別記錄加入不同濃度樣品后子宮收縮的頻率、張力和活動(dòng)力。

2.5.2 對(duì)離體子宮平滑肌催產(chǎn)素誘發(fā)收縮活動(dòng)的影響

標(biāo)本穩(wěn)定后，記錄6 min正常收縮曲線，加入0.02 U/mL催產(chǎn)素0.2 mL（營(yíng)養(yǎng)液19.6 mL），作用明顯后立即加入0.2 mL蒸餾水，記錄6 min收縮曲線；換洗4次，待曲線回復(fù)正常后，加入0.02 U/mL催產(chǎn)素0.2 mL（營(yíng)養(yǎng)液19.6 mL），作用明顯后立即加入1.5 mg/mL云南松松塔正丁醇提物混懸液0.2 mL，記錄6 min收縮曲線；換洗4次，待曲線回復(fù)正常后，加入0.02 U/mL催產(chǎn)素0.2 mL（營(yíng)養(yǎng)液19.6 mL），作用明顯后立即依次分別從低濃度到高濃度加入不同濃度樣品（操作同前），記錄6 min收縮曲線。觀察并分別記錄加入不同濃度樣品后子宮收縮的頻率、張力和活動(dòng)力。

2.5.3 對(duì)離體子宮平滑肌乙酰膽堿誘發(fā)收縮活動(dòng)的影響

標(biāo)本穩(wěn)定后，記錄6 min正常收縮曲線，然后加入0.1 mg/mL乙酰膽堿0.2 mL（營(yíng)養(yǎng)液19.6 mL），作用明顯后立即加入 0.2 mL蒸餾水，記錄6 min收縮曲線；換洗4次，待曲線回復(fù)正常后，加入0.1 mg/mL乙酰膽堿0.2 mL（營(yíng)養(yǎng)液19.6 mL），作用明顯后立即依次分別從低濃度到高濃度加入不同濃度樣品（操作同前），記錄6 min收縮曲線。觀察并分別記錄加入不同濃度樣品后子宮收縮的頻率、張力和活動(dòng)力。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 云南松松塔正丁醇提取物對(duì)正常大鼠離體子宮平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)的影響

與蒸餾水組比較：云南松松塔正丁醇提取物終濃度≥ 60 μg /mL時(shí)，可使正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的頻率、最大張力、活動(dòng)力顯著減慢（< 0.05或< 0.01）；與正常組比較：云南松松塔正丁醇提取物終濃度≥ 60 μg /mL時(shí)，可使正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的頻率、最大張力、活動(dòng)力顯著減慢（< 0.05或< 0.01）；結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 云南松松塔對(duì)正常大鼠離體子宮平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)的影響(±S, n=10)

注：與蒸餾水組比較☆< 0.05，☆☆< 0.01；與正常組比較★< 0.05，★★< 0.01。

3.2 云南松松塔正丁醇提取物對(duì)催產(chǎn)素誘導(dǎo)的大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響

與蒸餾水組比較：云南松松塔正丁醇提取物終濃度≥ 15 μg/mL時(shí)，可使催產(chǎn)素誘導(dǎo)的大鼠離體子宮平滑肌收縮的頻率顯著減慢，最大張力顯著減小，活動(dòng)力顯著減弱（< 0.05或< 0.01）；與正常組比較：云南松松塔正丁醇提取物終濃度≥ 15 μg/mL時(shí)，可使催產(chǎn)素誘導(dǎo)的大鼠離體子宮平滑肌收縮的頻率、最大張力顯著減小，活動(dòng)力顯著減弱（< 0.05或< 0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 云南松松塔對(duì)催產(chǎn)素誘導(dǎo)的大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響 (±S, n =10)

注：與蒸餾水組比較☆< 0.05，☆☆< 0.01；與正常組比較★< 0.05，★★< 0.01。

3.3 云南松松塔正丁醇提取物對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響

與蒸餾水組比較：云南松松塔正丁醇提取物終濃度≥ 15 ug /mL時(shí)，可使乙酰膽堿誘導(dǎo)的大鼠離體子宮平滑肌收縮的頻率顯著減慢，最大張力顯著減小，活動(dòng)力顯著減弱（< 0.01）；與正常組比較：云南松松塔正丁醇提取物終濃度≥ 60 μg/mL時(shí)，可使乙酰膽堿誘導(dǎo)的大鼠離體子宮平滑肌收縮的頻率、最大張力、活動(dòng)力顯著減弱（< 0.05或< 0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 云南松松塔對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響(± S, n=10)

注：與蒸餾水組比較☆< 0.05，☆☆< 0.01；與正常組比較★< 0.05，★★< 0.01。

4 討論

M型受體廣泛分布于中樞及周圍神經(jīng)組織、心肌、平滑肌和各種腺體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，通過(guò)與不同的鳥(niǎo)苷酸調(diào)節(jié)蛋白(G蛋白)結(jié)合，引起不同的生理生化效應(yīng)[17]。平滑肌對(duì)某些化學(xué)物質(zhì)有較高的敏感性，可以通過(guò)這些物質(zhì)刺激M、催產(chǎn)素受體等而使平滑肌收縮。其中，乙酰膽堿為M膽堿受體激動(dòng)藥，它的作用機(jī)制是與M受體具有強(qiáng)大的內(nèi)在活性，結(jié)合后產(chǎn)生強(qiáng)烈的收縮作用。本課題運(yùn)用乙酰膽堿、催產(chǎn)素使其與子宮平滑肌上相應(yīng)的受體結(jié)合后產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)，然后通過(guò)云南松松塔正丁醇提取物對(duì)相應(yīng)效應(yīng)的拮抗，從而研究云南松松塔正丁醇提取物的藥理作用及其作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：云南松松塔正丁醇提取物能夠使正常大鼠離體子宮平滑肌的自發(fā)收縮頻率顯著減慢、張力顯著減小、子宮活力顯著減弱；同時(shí)，也可以使大鼠離體子宮平滑肌催產(chǎn)素及乙酰膽堿的誘發(fā)收縮頻率顯著減慢、張力顯著減小、子宮活力顯著減弱。因此，可以認(rèn)為云南松松塔正丁醇提物具有抑制子宮平滑肌的作用，且其抑制作用可能跟阻斷催產(chǎn)素受體和M受體有關(guān)，其作用機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)云南松松塔的研究很多，松塔中含有二萜類、黃酮類、木脂素類、甾體類、酚類化合物、多糖及還原糖等多種化學(xué)成分。據(jù)《本草綱目》中記載，云南松松塔具有具有祛痰、止咳平喘、祛風(fēng)、潤(rùn)腸、安神等功效。此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)松塔還具有抗病毒[9]、抗氧化[10]、免疫增強(qiáng)[11]和抗腫瘤[12]等作用。本研究結(jié)果提示云南松松塔正丁醇提物具有抑制子宮平滑肌的作用，但是云南松塔化學(xué)成分復(fù)雜，不知道是哪種或者是哪幾種成分在發(fā)揮作用，依然需要今后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步分離提取。

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EFFECTS OF THE N-BUTANOL EXTRACTS FROM THE PINE CONES OFON ISOLATED RAT UTERINE SMOOTH MUSCLE

MA Ou, GUO Mei-xian, HE Zheng-chun,*YANG Yi-wen

(1. Zhaotong Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhaotong, Ynuan 657000, China; 2. College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali, Yunan 671000, China)

:To investigate the effects of the n-butanol extracts from the pine cones ofon the isolated rat uterine smooth muscle.: The isolated uterine smooth muscle was prepared from the rats, and then the effects of the n-butanol extracts from the pine cores ofon spontaneous contractions of isolated rat uterine smooth muscle were evaluated. Moreover, the effects of extracts on the contraction induced by oxytocin and acetylcholine in the isolated rat uterine smooth muscle were evaluated, respectively.: The n-butanol extracts from pine core ofcould significantly reduce the spontaneous contraction frequency, tension and uterine activity of the isolated rat uterine smooth muscle. Meanwhile, it also could reduce the contraction frequency, tension and uterine activity of the isolated rat uterine smooth muscle induced by oxytocin and acetylcholin, respectively.: The n-butanol extracts from the pine core ofhave an inhibitory effect on the contraction of isolated rat uterine smooth muscle, which may be related to the blocking of oxytocin receptors and M receptors.

pine cone of; isolated rat uterus; oxytocin; acetylcholine

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.05.018

1674-8085(2019)05-0091-05

2019-03-23；

2019-04-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 81260632)；云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 2012FD036)

馬 歐(1993-)，男，云南昭通人，藥師，碩士，主要從事臨床藥學(xué)工作(E-mail:1470946321@qq.com);

郭美仙(1980-)，女，云南鳳慶人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事藥理學(xué)研究(E-mail:yndllyo@126.com);

何正春(1973-)，男，云南大理人，副教授，博士，主要從天然藥物化學(xué)研究(E-mail:hezhengchun2006@163.com);

*楊毅雯(1978-），女，云南大理人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事外科學(xué)研究(E-mail:13987295797@163.com).