謝 彪， 高旭輝， 黃 洋， 周 翔， 譚智天， 朱水波△

(中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 1心胸外科， 2麻醉科， 湖北 武漢 430070)

自噬(autophagy)是指細(xì)胞內(nèi)的長壽命蛋白質(zhì)以及受損的細(xì)胞器經(jīng)溶酶體途徑被降解的過程，廣泛參與生長發(fā)育、免疫、新陳代謝和老化等生理性過程，普遍存在于真核細(xì)胞中。近期研究表明，細(xì)胞自噬的過度激活可導(dǎo)致另一種程序性細(xì)胞死亡——自噬性細(xì)胞死亡。遠(yuǎn)程缺血后處理(remote ischemic postconditioning，RIPostC)是在遠(yuǎn)端器官或部位進行短暫的、非致死性缺血和再灌注的處理方式。大量研究表明，這種處理方式可減輕心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation, CPR)后神經(jīng)功能障礙，然而其誘導(dǎo)的內(nèi)源性保護機制還不明確。本研究采用夾閉氣管導(dǎo)管建立窒息性心臟停搏(cardiac arrest，CA)/CPR模型，觀察遠(yuǎn)程缺血后處理對心肺復(fù)蘇后大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬水平的影響，并初步探討其保護機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與分組

雄性清潔級SD大鼠45只，體重200～300 g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證為SCXK(鄂)2016-0009。隨機分為3組，即假手術(shù)組(sham組，n=15)、CA/CPR組(n=15)和RIPostC組(n=15)。飼養(yǎng)室通風(fēng)、恒溫23 ℃，標(biāo)準(zhǔn)鼠料飼養(yǎng)。

2 實驗方法

2.1大鼠窒息性(CA/CPR)模型的建立 實驗大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水。2%戊巴比妥鈉2 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺，肢體導(dǎo)聯(lián)連接監(jiān)測心電圖。右側(cè)股動脈置入24G靜脈留置管，通過預(yù)充肝素的延長管連接壓力換能器，以Powerlab系統(tǒng)監(jiān)測血壓。左側(cè)股靜脈置入24G靜脈留置管，接輸液裝置，以備輸注急救藥物。經(jīng)口置入16G靜脈留置針軟套管，置管成功后作頸部正中切口，分離氣管予以粗線結(jié)扎，以防止機械通氣時漏氣影響窒息時心跳驟停效果。連接小動物呼吸機行機械通氣，調(diào)節(jié)呼吸參數(shù)，呼吸頻率60 min-1，潮氣量6 mL/kg，F(xiàn)iO221%，穩(wěn)定10 min。在呼氣末夾閉氣管導(dǎo)管，密切觀察大鼠血壓和心電圖變化，以收縮壓(systolic blood pressure，SBP)≤25 mmHg作為心跳驟停標(biāo)準(zhǔn)。達到心跳驟停標(biāo)準(zhǔn)后開始計時，持續(xù)5 min后開始機械通氣，呼吸頻率80 min-1，潮氣量6 mL/kg，F(xiàn)iO221%，同時依據(jù)節(jié)拍器節(jié)奏行快速、標(biāo)準(zhǔn)胸外按壓，按壓頻率200 min-1，按壓深度為大鼠胸廓前后徑的1/3，先后經(jīng)股靜脈快速注射腎上腺素(0.04 mg/kg)和1 mL萬汶(羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液)，并記錄血壓、心率和心電圖。若出現(xiàn)自主心律，且SBP高于60 mmHg并能維持10 min，則判定為自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation，ROSC)，若按壓3 min仍未出現(xiàn)自主心律或SBP低于60 mmHg則放棄搶救，視為復(fù)蘇失敗。復(fù)蘇成功者繼續(xù)呼吸機支持，自主呼吸恢復(fù)滿意即可停止機械通氣，結(jié)扎股動、靜脈并縫合皮膚切口，術(shù)后每6 h腹壁皮下注射10%葡萄糖2 mL，直至動物能自主飲水進食，放入單獨的鼠籠，置入23 ℃恒溫鼠舍繼續(xù)喂養(yǎng)。Sham組大鼠僅行動、靜脈插管和氣管插管等操作。

2.2遠(yuǎn)程缺血后處理 大鼠自主循環(huán)恢復(fù)后即刻用動脈夾夾閉左側(cè)股動脈5 min，再釋放5 min，依次重復(fù)3個循環(huán)。

2.3神經(jīng)功能缺損評分(neurological deficit scoring，NDS) 由1名不清楚實驗分組的人員于自主循環(huán)恢復(fù)后對實驗動物進行NDS評分，分別從一般行為、腦干反射、運動及感覺評估、行為學(xué)及癲癇發(fā)作等方面來評估神經(jīng)功能，范圍為0～80分，80分為正常，0分為腦死亡。

2.4Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的表達 大鼠處死后取新鮮海馬組織，經(jīng)過裂解，提取細(xì)胞總蛋白。測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，顯色，曝光，掃描膠片，結(jié)果用分析軟件ImageJ進行處理，GAPDH作為總蛋白內(nèi)參照對比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對含量。

2.5TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡 石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟，滴加蛋白酶K工作液，復(fù)染核，封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。大鼠海馬CA區(qū)選擇3個視野，計算各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。

2.6免疫熒光染色觀察LC3顆粒 常規(guī)石蠟切片、脫蠟，3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，高溫檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，加完 I 抗LC3(1∶100；Abcam，Ab192890)后于4 °C濕盒中孵育過夜。PBS清洗3次，滴加稀釋好的熒光(CY3)標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶100；武漢博士德生物工程有限公司，BA1032)，滴加DAPI對標(biāo)本進行染核，熒光顯微鏡下觀察采集圖像，Image-Pro Plus 6.0半定量LC3的表達。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠復(fù)蘇前后基本生理參數(shù)和相關(guān)指標(biāo)

各組大鼠在CA前體重、心率和平均動脈壓等的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠復(fù)蘇前后基本生理參數(shù)情況

2 各組大鼠不同時點的NDS評分

CA/CPR組各時點的NDS評分較對照組明顯降低(P<0.05)，提示CA/CPR組復(fù)蘇后神經(jīng)功能下降，存在腦組織損傷；而RIPostC組的NDS評分增高(P<0.05)，提示遠(yuǎn)程缺血后處理可改善神經(jīng)功能，見表2。

表2 各組大鼠不同時點NDS評分比較

Table 2.Comparison of NDS scores of the rats in different groups at different time points (Mean±SD.n=9)

Group12 h24 hSham78.9±1.180.0±0.0CA/CPR49.8±3.4△57.1±4.7△RIPostC56.8±3.8*64.0±3.5*

△P<0.05νssham group;*P<0.05νsCA/CPR group.

3 自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的表達

與sham組比較，CA/CPR組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1表達在ROSC后24 h明顯升高(P<0.05);與CA/CPR組比較，RIPostC組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1表達在ROSC后24 h明顯降低(P<0.05)，提示RIPostC抑制自噬相關(guān)蛋白的表達，降低細(xì)胞自噬水平，見圖1。

4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示sham組凋亡細(xì)胞少見，凋亡率為(2.53±0.60)%；CA/CPR組可見較多凋亡細(xì)胞，凋亡率為(18.54±3.67)%；RIPostC組凋亡率為(9.78±1.60)%，較CA/CPR組顯著降低(P<0.05)，見圖2。

5 免疫熒光結(jié)果分析

對照組LC3顆粒形成較少，平均吸光度值為(3.88±0.72)%；CA/CPR組的海馬神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)可見明顯LC3顆粒形成，平均吸光度值為(9.18±1.11)%；RIPostC組的平均吸光度值為(6.06±0.34)%，較CA/CPR組顯著降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 1.Comparison of relative protein expression levels of LC3-II/LC3-I and beclin-1 in each group of the neural cells. Mean±SD.n=5.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsCA/CPR group.

圖1 各組神經(jīng)細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1相對蛋白表達水平比較

Figure 2.Comparison of apoptotic rate of neural cells in each group (×400). Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsCA/CPR group.

圖2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的比較

Figure 3.Formation of LC3 particles in rat neural cells in each group (×400). Mean±SD.n=3.△P<0.05vssham group;*P<0.05vsCA/CPR group.

圖3 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞胞漿LC3顆粒形成

6 透射電鏡結(jié)果

Sham組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)未見明顯自噬體，線粒體外膜完整， 嵴光滑清晰可見， 基質(zhì)均勻；CA/CPR組的神經(jīng)元內(nèi)可見較多自噬泡(黑色箭頭所示)，線粒體體積縮小， 嵴紊亂、粗糙，基質(zhì)濃縮；RIPostC組神經(jīng)元內(nèi)自噬泡較少(黑色箭頭所示)，線粒體體積略有縮小， 嵴可分辨，基質(zhì)濃度略不均勻，見圖4。

Figure 4. Autophagosome and mitochondrial ultrastructure of hippocampal neural cells in each group (×5 000).

圖4 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬體和線粒體超微結(jié)構(gòu)

討 論

心臟停搏是嚴(yán)重危害人類健康與生存的急危重癥之一，盡早恢復(fù)血液灌注是治療心跳驟停最有效的措施，然而腦缺血一定時間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不但未能恢復(fù)，卻出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦機能障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷[1]。復(fù)蘇后腦損傷是心跳驟?；颊呋謴?fù)自主循環(huán)后期死亡和致殘最主要的原因[2]。遠(yuǎn)程缺血處理是目前研究較為廣泛的一種內(nèi)源性神經(jīng)保護策略，因其簡單方便，可操作性強，具有較好的臨床應(yīng)用前景。在這項研究中，筆者發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)程缺血后處理可改善復(fù)蘇后神經(jīng)功能，并降低復(fù)蘇后的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是一種有效的腦保護策略，這與許多研究結(jié)果一致[3-5]，然而其機制仍不清楚。

自噬是真核細(xì)胞的一種自我保護機制，通過對長半衰期蛋白及細(xì)胞器的降解和再利用來滿足細(xì)胞代謝的需要，對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用[6-7]。LC3定位于自噬體內(nèi)外膜，參與自噬體的形成。其有 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ 2種存在形式，自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾并與自噬膜表面的脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ被通常用作檢測哺乳動物自噬活性的重要指標(biāo)[8]。在生理狀態(tài)下，beclin-1與Bcl-2緊密結(jié)合，而缺血缺氧時，beclin-1與Bcl-2分離并參與自噬體的形成以及調(diào)節(jié)其它自噬蛋白在自噬前體膜的定位，其表達水平與細(xì)胞自噬水平正相關(guān)，是調(diào)控自噬的重要靶點[9]。近期研究表明適當(dāng)自噬可以保護細(xì)胞，而自噬過度激活時，可引起自噬性細(xì)胞死亡。Shi等[10]在缺氧缺糖的體外細(xì)胞實驗中證明過度的自噬可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡；Cui等[11]在心跳驟停的動物模型上驗證了自噬的激活介導(dǎo)復(fù)蘇后期海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡。因而我們推測遠(yuǎn)程缺血處理的保護機制可能與抑制復(fù)蘇后腦海馬組織的自噬有關(guān)。

本研究用Western blot、免疫熒光和透射電鏡的方法來判斷大鼠心肺復(fù)蘇后神經(jīng)細(xì)胞自噬水平的變化。研究結(jié)果顯示，ROSC后24 h大鼠腦海馬組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1表達相比sham組明顯增加，免疫熒光檢測提示海馬神經(jīng)細(xì)胞胞漿LC3顆粒形成增多，透射電鏡檢查可看見神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的自噬泡，提示神經(jīng)細(xì)胞存在自噬水平的激活，而RIPostC組降低了自噬相關(guān)蛋白的表達，減少LC3顆粒形成，提高心肺復(fù)蘇后大鼠NDS評分，說明RIPostC組抑制了腦海馬組織的自噬水平，減輕了神經(jīng)細(xì)胞過度自噬而導(dǎo)致的腦損傷，這也進一步驗證了我們的推測。遠(yuǎn)程缺血后處理的腦保護機制主要通過內(nèi)源性的神經(jīng)和體液機制來實現(xiàn)。Zhou等[4]研究發(fā)現(xiàn)，這種處理方式可以通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放來實現(xiàn)腦保護作用。另外2項研究表明，這種處理方式可能通過減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來發(fā)揮神經(jīng)保護機制[12-13]。我們的研究主要從細(xì)胞自噬的角度進一步闡明了其內(nèi)源性的神經(jīng)保護機制。

綜上所述，遠(yuǎn)程缺血后處理可以減輕心肺復(fù)蘇后海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能，這種保護作用可能與抑制腦海馬神經(jīng)細(xì)胞過度自噬有關(guān)，但調(diào)控自噬水平的具體分子機制有待進一步研究。