阿孜古麗·要力瓦斯， 毛吾蘭·買買提依明， 迪麗娜孜·艾爾肯， 夏米西努爾·伊力克

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室， 新疆 烏魯木齊 830054)

女性的生殖系統(tǒng)是應(yīng)激反應(yīng)的重要系統(tǒng)之一，且易受應(yīng)激的損害，受到損害后主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)甚至不孕等[1]。隨著醫(yī)學(xué)模式向生物-心理-社會模式轉(zhuǎn)變，女性在社會及家庭中的責(zé)任及壓力日益増加，女性的身心健康受到環(huán)境、社會、心理等因素的影響亦越來越凸顯，由長期的心理緊張或突發(fā)事件導(dǎo)致機(jī)體的應(yīng)激，對女性的生殖損害尤為顯著[2-5]。各種身心應(yīng)激均導(dǎo)致卵巢功能損害，進(jìn)而發(fā)展為卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，常伴有烘熱汗出、潮熱多汗、胸悶心慌、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、肢體浮腫等絕經(jīng)前后諸癥。POF是指婦女在40歲以前由于各種原因出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng)，除此之外還伴有卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)及黃體生成素(luteinizing hormone，LH)升高，而雌二醇(estradiol，E2)降低的綜合征[6]。因此，探討慢性應(yīng)激致性腺軸失調(diào)的發(fā)病機(jī)制，尋找其防治的潛在靶點是目前迫切需要解決的臨床難題[7]。

下丘腦-垂體-性腺軸在人類生殖系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌功能中起著重要的作用。在女性生殖系統(tǒng)中，下丘腦分泌促性腺激素釋放激素，通過調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌，使卵巢功能得以調(diào)控[8-9]。卵巢結(jié)構(gòu)的變化可能導(dǎo)致下丘腦-垂體-卵巢軸之間的協(xié)調(diào)性反應(yīng)銳減，不能控制性腺軸的正、負(fù)反饋作用，因垂體分泌大量的促性腺激素，而卵巢卻不能正常分泌性激素，所以血中促性腺激素相對增加[8, 10]。木尼孜其可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌水平，治療各種內(nèi)分泌紊亂引起的婦科炎癥和更年期綜合征。本研究通過分析卵巢早衰大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的形態(tài)學(xué)變化，通過Masson染色觀察各組大鼠卵巢纖維化程度，初步確認(rèn)卵巢早衰大鼠的組織形態(tài)學(xué)病因，再用中藥木尼孜其進(jìn)行干預(yù)，確認(rèn)該藥在卵巢早衰大鼠中對性腺軸的改善作用[11]。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及其分組

通過陰道涂片實驗篩選出清潔級2月齡左右的性成熟雌性SD大鼠90只，動物合格證號為SYXK(新)2018-0003，平均體質(zhì)量為220～240 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周之后，開始進(jìn)行造模。隨機(jī)抽取10只為正常對照組(normal組)，其余80只進(jìn)行 POF造模。

2 主要試劑及儀器

木尼孜其合劑(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院)；Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；E2、FSH和LH ELISA試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。 RXZ型人工氣候箱(寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司)；ZBY-149-83型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；EM-1230型透射式電子顯微鏡(GATAN)；DM3000型數(shù)碼顯微鏡(Leica)。

3 實驗方法

3.1慢性應(yīng)激所致POF模型的建立 模型大鼠置于氣候箱中飼養(yǎng)，溫度為(7±1)℃，濕度為(85±5)%，在濕寒環(huán)境下飼養(yǎng)。在造模過程中，normal組每日給予常規(guī)飼料500 g、飲用水500 mL、木屑墊料150 g及正常光照；應(yīng)激模型組每日給予特殊屬性飼料500 g、飲用水500 mL、木屑墊料150 g及正常光照。白天normal組與POF模型動物均隨機(jī)飲食水，每周選擇同一固定時點觀測并記錄生物學(xué)表征如體重、進(jìn)食量、飲水量、尿量、大便量等并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析[11]。

3.2實驗分組 正常對照組：放置于常規(guī)環(huán)境[溫度為(20±2)℃，濕度為55%～65%]中飼養(yǎng)，每日隨機(jī)飲食水。并定時觀測各組大鼠生物學(xué)表征的變化。

慢性應(yīng)激POF大鼠的分組及藥物干預(yù)：建立慢性應(yīng)激動物模型后，從大鼠眼眶靜脈叢進(jìn)行采血并通過ELISA法檢測外周血清中E2、LH及FSH的含量，應(yīng)激模型組各大鼠激素含量與normal組大鼠激素含量進(jìn)行比較，并結(jié)合應(yīng)激組各大鼠發(fā)情周期的變化篩選出POF模型動物共38只，將其隨機(jī)分為POF模型組(POF組)、POF藥物干預(yù)高劑量組(PTH組)、POF藥物干預(yù)中劑量組(PTM組)和POF藥物干預(yù)低劑量組(PTL組)；成模后上述藥物干預(yù)組用中藥木尼孜其合劑分高、中、低3種劑量灌胃，其劑量分別為46.86 mL/kg 、23.43 mL/kg和11.72 mL/kg，其中高劑量組與中劑量組分早、晚2次灌胃，藥物干預(yù)時間為2周。

3.3觀察指標(biāo) 垂體、下丘腦及卵巢組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、烘干等處理，備做HE染色，卵巢組織還備做Masson染色。卵巢指數(shù)：將大鼠處死之后速取大鼠雙側(cè)卵巢，去除周圍多余脂肪組織，用分析天平稱重并記錄，大鼠卵巢指數(shù)(%)=大鼠卵巢濕重/該大鼠體質(zhì)量×100%。子宮指數(shù)：將大鼠處死之后速取大鼠子宮，用分析天平稱重并記錄，大鼠子宮指數(shù)(%)=大鼠子宮濕重/該大鼠體質(zhì)量×100%。

4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 卵巢指數(shù)

處理取材肉眼發(fā)現(xiàn)，POF組卵巢發(fā)生水腫且表面伴有黃色脂肪，卵巢組織結(jié)構(gòu)疏松；據(jù)統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POF組大鼠卵巢指數(shù)較normal組大鼠顯著增大(P<0.05)；經(jīng)過藥物干預(yù)之后， POF模型高、中、低各劑量藥物干預(yù)組卵巢指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，并且高劑量干預(yù)組效果比中、低劑量組更加明顯，見表1，提示中藥木尼孜其可以有效改善應(yīng)激所致的卵巢指數(shù)的異常改變。

表1 各組大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)和卵巢膠原纖維面積比的比較

Table 1.The ovary index, uterus index and the area ratio of collagen fibers in the ovary in the rats of each group (Mean±SD)

TreatmentnOvary index(×10-2 mg/g)Uterine index(×10-2 mg/g)Collagen fiber area ratio in ovaryNormal100.431±0.0551.468±0.0739.13±2.47POF100.608±0.055*1.623±0.098*34.61±7.98*PTH90.499±0.053#1.508±0.092#20.20±5.07#PTM100.512±0.049#1.515±0.084#23.71±6.32#PTL90.515±0.071#1.561±0.10130.49±5.02

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPOF group.

2 子宮指數(shù)

處死大鼠之后取出子宮發(fā)現(xiàn)，POF組子宮發(fā)生腫脹，失去其正常形態(tài)；據(jù)統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POF組大鼠子宮指數(shù)較normal組大鼠顯著增大(P<0.05)；POF模型高、中劑量藥物干預(yù)組子宮指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，但低劑量組與POF組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見表1，提示中藥木尼孜其可以在一定程度上調(diào)節(jié)應(yīng)激所致的子宮指數(shù)紊亂。

3 HE染色觀察下丘腦、垂體和卵巢組織的病理學(xué)改變

normal組大鼠的下丘腦間質(zhì)無水腫，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞比較豐富，結(jié)構(gòu)清晰，體積均勻；POF組大鼠的下丘腦出現(xiàn)間質(zhì)水腫(空泡樣改變)，神經(jīng)元核固縮，排列紊亂，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少；PTH組神經(jīng)元豐富，細(xì)胞核質(zhì)分明，結(jié)構(gòu)清晰，偶見神經(jīng)元壞死，間質(zhì)出現(xiàn)輕度水腫；PTM組的神經(jīng)元數(shù)目較PTH組少，可見神經(jīng)元壞死，空泡樣改變較多；PTL組的神經(jīng)元稀少，間質(zhì)疏松，細(xì)胞排列紊亂，見圖1。

Figure 1.HE staining of hypothalamus in the rats of each group (×400).

圖1 各組大鼠下丘腦的HE染色

normal組大鼠垂體的嗜酸性細(xì)胞及嗜堿性細(xì)胞數(shù)目豐富，血竇數(shù)目豐富，基質(zhì)緊密；POF組大鼠垂體的基質(zhì)疏松，間質(zhì)呈空泡樣改變，可見出現(xiàn)嚴(yán)重水腫；藥物干預(yù)之后，PTH組大鼠垂體的嗜酸性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，水腫明顯好轉(zhuǎn)，排列致密；PTM組大鼠垂體的血竇豐富，嗜酸性細(xì)胞增多，基質(zhì)相對致密；PTL組大鼠垂體以嗜堿性細(xì)胞為主，基質(zhì)比較疏松，偶見血竇，見圖2。

normal組大鼠可見卵巢各級卵泡清晰可見，黃體數(shù)目較多，顆粒細(xì)胞排列整齊，卵泡腔大且卵泡液豐富，偶見閉鎖卵泡；POF組大鼠的各級卵泡稀少，可見大量閉鎖卵泡，黃體較少，顆粒細(xì)胞排列不整齊，部分被纖維組織代替，囊狀閉鎖卵泡增多，空泡樣變化多，說明卵巢水腫嚴(yán)重，間質(zhì)腺增生且伴有纖維化；經(jīng)過藥物干預(yù)，PTH組大鼠出現(xiàn)次級卵泡與初級卵泡，閉鎖卵泡數(shù)目減少，顆粒細(xì)胞較豐富，黃體增多卵泡發(fā)育良好；PTM組未見明顯次級卵泡，出現(xiàn)脂肪增生，黃體較豐富，間質(zhì)增生；PTL組大鼠未見各級卵泡，卵泡腔小且顆粒細(xì)胞脫落到卵泡液，開始出現(xiàn)黃體，見圖3。

Figure 2.HE staining of pituitary in the rats of each group (×400).

圖2 各組大鼠垂體的HE染色

Figure 3.HE staining of ovary in the rats of each group (×100).

圖3 各組大鼠卵巢HE染色

4 Masson染色觀察各組大鼠卵巢的纖維化程度

normal組大鼠主要是卵泡膜以及血管上皮出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象，而且纖維化程度較低；POF組大鼠不僅卵泡膜周圍出現(xiàn)高度纖維化，而且從黃體膜顆粒滲入到黃體顆粒細(xì)胞，纖維化程度高； PTH組大鼠的黃體及間質(zhì)腺纖維化程度低，卵泡膜以及間質(zhì)中度纖維化；PTM組卵泡顆粒層以及在間質(zhì)腺中依然存在纖維化現(xiàn)象，較POF組大鼠其纖維化程度明顯降低；PTL組黃體顆粒細(xì)胞以及卵泡顆粒層中存在大量纖維化，且膠原纖維從黃體中央開始向四周彌漫擴(kuò)散，見圖4。POF組纖維化程度較normal組大鼠顯著升高(P<0.05)；PTH組、PTM組和PTL組大鼠較POF組大鼠纖維化程度分別降低了45.62%、33.49%和14.89%，其中PTH組、PTM組與POF組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，POF組與PTL組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見表1。

Figure 4.Masson staining of ovaries in the rats of each group (×100).

圖4 各組大鼠卵巢Masson染色

5 各組大鼠血清中 E2、FSH和LH 水平的變化

與正常對照組比較，模型組大鼠的血清 E2水平明顯降低 (P<0.05)，F(xiàn)SH和LH 的水平顯著升高(P<0.05); 與POF組比較，各藥物干預(yù)組的E2水平明顯升高，F(xiàn)SH和LH水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清激素水平的變化

Table 2.The changes of the serum hormone levels in the rats of each group (Mean±SD)

TreatmentnE2 (ng/L)FSH (U/L)LH (U/L)Normal1049.17±5.872.34±0.673.72±1.13POF1021.09±7.80*8.57±0.89*8.84±1.51*PTH 938.81±6.11#4.14±0.35#4.75±0.45#PTM1033.97±5.56#4.19±0.59#5.45±0.87#PTL 931.97±4.63#5.14±0.76#5.72±1.17#

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPOF group.

討 論

應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受到威脅時機(jī)體對應(yīng)激原產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)?，F(xiàn)代社會充滿了各種應(yīng)激原，女性在社會中正承擔(dān)著越來越多的責(zé)任及壓力，機(jī)體常常處于應(yīng)激狀態(tài)[12]。臨床研究表明擁有過高感知覺壓力的女性LH水平降低和FSH水平增高，血清雌二醇和黃體孕激素水平降低，不排卵周期增加。低正性情感能夠加速女性卵巢儲備的消耗，且慢性心理社會應(yīng)激原是血清FSH水平的獨立相關(guān)因素，慢性應(yīng)激是卵巢儲備下降的預(yù)測因素[7]。近年來隨著研究的深入，應(yīng)激在下丘腦、垂體，尤其是卵巢水平對卵巢功能的影響機(jī)制被進(jìn)一步揭示，本文探討下丘腦-垂體-卵巢軸尤其是卵巢的病理生理原因從不同角度研究，為臨床改善應(yīng)激導(dǎo)致的卵巢功能低下提供可能的理論依據(jù)[8]。

卵巢早衰是由于多種原因所致卵巢功能衰竭，分泌雌激素的能力下降,因而對性腺軸的負(fù)反饋作用減弱,導(dǎo)致垂體分泌的FSH及LH激素水平上升，其中以FSH的上升更為顯著[13]。FSH在卵泡發(fā)育中起著重要作用，參與卵泡的募集、選擇、優(yōu)勢卵泡的發(fā)育及成熟各個階段,這些作用是通過結(jié)合受體而完成的。如果產(chǎn)生與受體結(jié)合障礙、受體變異、或受體結(jié)合后作用障礙，將會導(dǎo)致原發(fā)性閉經(jīng)。POF模型大鼠的外周血E2激素水平降低均顯著低于正常對照組，這可能與濕、寒等慢性應(yīng)激因素影響卵巢的正常結(jié)構(gòu)，各級卵泡數(shù)量降低，使得卵巢儲備功能降低直接影響卵巢分泌E2使體內(nèi)激素平衡紊亂導(dǎo)致卵巢早衰。POF模型大鼠的FSH和LH水平顯著高于正常對照組，這可能也是一方面在濕、寒環(huán)境使垂體的正常結(jié)構(gòu)受到影響的結(jié)果，另一方面雌激素之間相互作用通過反饋機(jī)制作用于下丘腦，引起FSH、LH等促性腺激素分泌的改變。

本研究通過分析POF大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的形態(tài)學(xué)變化，通過Masson染色及HE染色觀察各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)變化，初步確認(rèn)POF大鼠的組織形態(tài)學(xué)病因，通過中藥木尼孜其的藥物干預(yù)作用，確認(rèn)其在POF大鼠中對性腺軸的改善作用。在研究中HE染色結(jié)果顯示POF大鼠下丘腦出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量壞死現(xiàn)象，壞死之后出現(xiàn)間質(zhì)水腫(空泡樣改變)，神經(jīng)元核固縮，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少[14]。其垂體基質(zhì)疏松，間質(zhì)呈空泡樣改變，可見出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，嗜酸性細(xì)胞明顯減少與此同時嗜堿性細(xì)胞明顯增多，嗜酸性細(xì)胞主要與生長類激素的分泌有關(guān)，POF大鼠生長速度較正常組明顯降低，這可能與垂體中嗜酸性細(xì)胞的減少有一定的關(guān)系，同時嗜堿性細(xì)胞與促性腺激素的釋放有關(guān)，說明FSH及LH水平的異常上升可能與垂體中嗜堿性細(xì)胞的異常增多有一定關(guān)系，其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。POF大鼠卵巢中未見明顯初級、次級卵泡，囊狀閉鎖卵泡增多，空泡樣變化多，說明卵巢水腫嚴(yán)重，間質(zhì)腺增生且伴有纖維化[15]。最后通過Masson染色觀察卵巢纖維化程度，結(jié)果表明不僅卵泡膜周圍出現(xiàn)高度纖維化，而且膠原纖維從黃體膜顆粒滲入到黃體顆粒細(xì)胞，纖維化程度高。經(jīng)過中藥木尼孜其的干預(yù)，POF大鼠性腺軸相關(guān)各組織形態(tài)病理學(xué)變化得到有效改善，其中高劑量藥物干預(yù)作用最佳。中藥木尼孜其可能通過改善調(diào)節(jié)女性下丘腦-垂體-卵巢軸各組織的病理學(xué)變化，從而進(jìn)一步調(diào)整POF大鼠出現(xiàn)的內(nèi)分泌紊亂等現(xiàn)象。