祝傳靜 李柳青 黃建洪 田森林 胡學(xué)偉

（昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650500）

礦山開采、化工、制藥、煙氣脫硫等生產(chǎn)過程都會產(chǎn)生大量含硫酸鹽廢水，其不僅導(dǎo)致設(shè)備結(jié)垢，還會在厭氧條件下生成硫化氫等生物毒性組分，傳統(tǒng)處理方法（如化學(xué)沉淀法等）存在設(shè)備腐蝕結(jié)垢、藥劑消耗大及廢渣產(chǎn)量大等問題［1-2]。硫酸鹽還原菌（Sulphate reducing bacteria，SRB）在電子供體充足情況下可實(shí)現(xiàn)對硫酸鹽的生化轉(zhuǎn)化，其具有反應(yīng)條件溫和、固廢產(chǎn)量小及回收硫資源等優(yōu)點(diǎn)［3-4]而受到廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)SRB常以醇類、有機(jī)酸類和糖類等為電子供體［5]，但該類可溶性有機(jī)電子供體投加量大、運(yùn)行成本高、出水殘留有機(jī)物濃度高，而需要后續(xù)深度處理［6]，因此尋求新型SRB電子供體具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

自Widdel等［7]發(fā)現(xiàn)合成氣（H2/CO2/CO）可供微生物利用，Dupreez等［8]證明合成氣可用作生物硫酸鹽還原的電子供體，加之合成氣具有來源廣泛、價(jià)格低廉、單位質(zhì)量供電子量大、出水殘留COD濃度較低等顯著優(yōu)勢，在硫酸鹽廢水處理領(lǐng)域受到持續(xù)關(guān)注。本文主要綜述SRB利用氣體作為電子供體時(shí)的反應(yīng)機(jī)理和影響因素（環(huán)境因子、氣體傳質(zhì)、涉硫組分和供體競爭）、氣體特性及代謝轉(zhuǎn)化對硫酸鹽還原的影響，以期對后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 以氣體為電子供體的反應(yīng)機(jī)理

SRB以氣體作為電子供體，其通過對分子氫的直接利用，氫擴(kuò)散穿過細(xì)胞質(zhì)膜，在氫化酶及色素C3作用下，膜轉(zhuǎn)移用于細(xì)胞質(zhì)的電子受體還原，利用過程如圖1所示。在該還原過程中，SRB消耗電子供體的量受電子受體的分子量及形態(tài)影響，如電子受體較消耗的供體H2少［見等式（1）和（2）］，且的代謝中間產(chǎn)物在H2氛圍下會歧化生成硫酸鹽和硫化物［見等式（3）和（4）］。

以H2/CO2作為電子供體/碳源，在SRB生化還原中的反應(yīng)：

由于CO具有毒性，大多數(shù)SRB只能在較低的CO濃度條件下生長且它們生長代謝存在差異。部分SRB（如Desulfotomaculum carboxydivorans）能直接利用CO作為電子供體進(jìn)行硫酸鹽還原產(chǎn)生硫化物［12]；存在著部分厭氧菌（如Carboxydothermu hydrogenoformans）可將CO代謝轉(zhuǎn)化為H2和CO2［13-14]，CO2易溶于水生成 HCO3-，SRB可利用該類厭氧菌產(chǎn)生的H2和CO2進(jìn)行硫酸鹽還原；大部分SRB（ 如D. kuznetsovii和D. thermobenzoicumsubsp.thermosyntrophicum）利用CO時(shí)會受到CO抑制影響［15]。

圖1 SRB利用氣體為電子供體的酶定位、氫循環(huán)示意圖

以CO作為電子供體，在SRB生化還原中的反應(yīng)：

能夠進(jìn)行無機(jī)化學(xué)營養(yǎng)生長的細(xì)菌屬于自養(yǎng)型。通常，能利用H2作為電子供體進(jìn)行產(chǎn)能代謝的自養(yǎng)型SRB具有兩種不同類型的氫化酶，一種是在細(xì)胞質(zhì)里的氫化酶用于吸收H2，另一種是膜結(jié)合氫化酶用于產(chǎn)能作用。另外，能利用CO作為電子供體的SRB還需具有CO脫氫酶［16]。在自養(yǎng)型SRB代謝過程中，除氫化酶起重要作用外，細(xì)胞色素C3可起到傳遞電子的作用，對SRB還原活性的提高有幫助（表 1）。

自養(yǎng)型SRB通過利用H2/CO2、CO等電子供體進(jìn)行代謝產(chǎn)生ATP、一些小分子的物質(zhì)或分解代謝過程中的中間產(chǎn)物用于生物固碳合成細(xì)胞物質(zhì)，其采用的固碳機(jī)制是還原型三羧酸循環(huán)（rTCA）和還原型乙酰輔酶 A 循環(huán)。rTCA 循環(huán)由 Evans 等［18]在1966 年提出，在rTCA 循環(huán)中兩分子的CO2可以合成一分子的乙酰輔酶 A，如圖2所示，rTCA循環(huán)中大多數(shù)酶（蘋果酸脫氫酶、延胡索酸水合酶、琥珀酰輔酶 A 合成酶、異檸檬酸脫氫酶以及烏頭酸水合酶）催化反應(yīng)都是可逆的，其中延胡索酸還原酶、2-酮戊二酸合成酶以及檸檬酸裂解酶是 rTCA 循環(huán)特有的酶。Aoshima等［19]報(bào)道rTCA 循環(huán)中包括兩個(gè)羧化反應(yīng)：2-酮戊二酸合成酶催化的琥珀酸輔酶 A轉(zhuǎn)化成 2-酮戊二酸；由異檸檬酸脫氫酶或酮戊二酸和草酰琥珀酸還原酶催化的羧基化反應(yīng)（2-酮戊二酸羧基化為異檸檬酸）。ATP 依賴型檸檬酸裂解為乙酰輔酶 A 的反應(yīng)被認(rèn)為是 rTCA 循環(huán)中的關(guān)鍵反應(yīng)，這個(gè)關(guān)鍵反應(yīng)由 ATP 檸檬酸裂解酶單獨(dú)催化或者由檸檬酰輔酶 A 合成酶和檸檬酰輔酶 A 裂解酶共同催化。還原型乙酰輔酶 A 途徑最早由 Drake等［20]和Ljungdahl［21]團(tuán)隊(duì)在產(chǎn)乙酸菌中發(fā)現(xiàn)，其反應(yīng)途徑為兩分子CO2直接以非環(huán)化的方式合成乙酰輔酶 A，最終產(chǎn)物為乙酸，其中起作用的關(guān)鍵酶為CO脫氫酶。

表1 氫化酶和細(xì)胞色素C3對SRB的還原影響

2 以氣體為電子供體的影響因素

2.1 環(huán)境因子

環(huán)境因子的變化會影響SRB的生命活動，只有當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，SRB的生命活動才能正常進(jìn)行，否則其生命活動就會受到抑制、引起變異或死亡。SRB可在氯化鈉含量小于0.818%的環(huán)境中進(jìn)行生長，大于2.45%時(shí)其生長受到完全抑制。pH不僅會影響SRB對硫酸鹽的轉(zhuǎn)化，還會導(dǎo)致微生物聚集體的變化，Van Houten等［23]以H2/CO2為電子供體及碳源進(jìn)行硫酸鹽還原發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 7.0-7.5時(shí)，硫酸鹽轉(zhuǎn)化速率為16 g SO42-/（L·d），SRB 聚集體為不規(guī)則球狀；pH從7.5上升至8.0，硫酸鹽轉(zhuǎn)化速率較pH 7.5時(shí)降低，且聚集體表面變得更不規(guī)則；當(dāng)pH降低至6.5時(shí)，硫酸鹽轉(zhuǎn)化速率及聚集體無明顯變化；pH繼續(xù)降至5.5時(shí)，總硫酸鹽轉(zhuǎn)化速率急劇下降至2 g SO42-/ L·d-1，聚集體由原來的球狀變?yōu)榻z狀和螺旋狀。SRB作為嚴(yán)格的厭氧菌，其具有一定的抗氧能力［24]，但其細(xì)胞內(nèi)各種生物化學(xué)反應(yīng)都需在特定的ORP范圍內(nèi)完成，Chang等［25]和Neufeld等［26]發(fā)現(xiàn) SRB只有在ORP＜-100的條件下才能正常生長，隨著ORP的升高，SRB還原活性下降；徐慧緯等［27]研究表明在SRB反應(yīng)過程中ORP＜-350 mV時(shí)，與pH、SO42-濃度相比，ORP不再是影響硫酸鹽還原速率的主要因素。溫度是厭氧沉積物中硫酸鹽還原作用的主要環(huán)境參數(shù)，Van Houten等［23，28]在中溫（30℃）條件下獲得最大硫酸鹽轉(zhuǎn)化率30 g SO42-/（L·d）；Nevatalo等［29]發(fā)現(xiàn)在 35℃時(shí) HSRB的還原活性最強(qiáng)92 mmol/（gVSS·d），隨著溫度的降低，HSRB還原活性降低。

2.2 氣體傳質(zhì)

氣體傳質(zhì)主要是在壓力梯度驅(qū)動下的氣體流動傳質(zhì)。氣體傳質(zhì)限制會影響SRB的厭氧生化轉(zhuǎn)化，可通過加強(qiáng)生物反應(yīng)器中的氣體傳質(zhì)，來提高SRB還原效率。Van Houten等［28]通過改變反應(yīng)器內(nèi)H2濃度，驗(yàn)證了硫酸鹽的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)化是由于H2的傳質(zhì)限制。Sipma等［17]發(fā)現(xiàn)脫硫腸狀菌屬D.carboxydivorans對CO的轉(zhuǎn)化受氣體傳質(zhì)影響。

由于H2、CO在水中的溶解度較小，為增加該類氣體（電子供體）在水中的溶解濃度和傳質(zhì)效果，有學(xué)者通過膜供應(yīng)氣態(tài)底物、增大氣體壓力等方法來強(qiáng)化氣液傳質(zhì)。Fedorovich等［30]利用微孔（0.45 μm）疏水性膜向反應(yīng)器提供H2，得出氣體傳質(zhì)和反應(yīng)器液體不適當(dāng)?shù)幕旌喜焕诘蜐舛攘蛩猁}還原。Tang等［31]發(fā)現(xiàn)復(fù)合中空纖維的氣體輸送率較單壁聚酯高，但其存在成本高、沉淀物易堵塞孔隙的缺點(diǎn)；Ontiveros-Valencia等［32-35]研究了硫酸鹽還原菌（Sulphate reducing bacteria，SRB）、反硝化菌（Denitrifying bacteria，DB）和高氯酸鹽還原菌（Perchlorate-reducing bacteria，PRB）的共存關(guān)系，發(fā)現(xiàn)氣體壓力的增加有助于硫酸鹽還原。針對氣體加壓存在能耗大、運(yùn)行成本高、氣壓存在上限等問題，徐慧緯等［27]采用兩室型生物-電化學(xué)系統(tǒng)通過附加直流電的方式來供H2，得出當(dāng)I =1.50 mA時(shí)，硫酸鹽平均還原速率最高。符詩雨和駱海萍等［36]利用雙極室微生物電解系統(tǒng)（Microbial electrolysis system，MES）供氫，外加電壓為0.8 V時(shí)，硫酸鹽的去除率較高，平均硫酸鹽還原速率可達(dá)73.2 mg/L·d。

2.3 涉硫組分

在中性pH 7時(shí)，硫酸鹽還原產(chǎn)物是等量的H2S和HS-［等式（5）（9）]。在pH 5時(shí)，約99%的產(chǎn)物是 H2S［等式（8）（10）]，如下列等式［38]：

H2S 是 pH ＜7 時(shí)抑制作用最強(qiáng)的硫化物［38-39]，但H2S對微生物的抑制機(jī)理尚未明確。其中一種假說認(rèn)為H2S可自由穿過細(xì)胞膜，一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，就假定硫化物與細(xì)胞色素中的鐵、其他細(xì)胞內(nèi)含鐵化合物結(jié)合，從而抑制細(xì)菌生長甚至死亡［40]。另一種假說則認(rèn)為在偏酸性條件下，硫酸鹽還原產(chǎn)生的大量H2S穿過細(xì)胞膜后，在細(xì)胞質(zhì)中解離并釋放出質(zhì)子，使質(zhì)子動力不穩(wěn)定，從而抑制ATP的生成，并且SRB所獲得的大部分能量被用于pH穩(wěn)態(tài)而不是細(xì)菌生長，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［41]。Bijmans等［39]研究了pH為5的高硫酸鹽SRB反應(yīng)器中硫化物的去除對反應(yīng)器性能和微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)硫化物的去除提高了硫酸鹽的轉(zhuǎn)化，若未去除硫化物，不僅硫酸鹽轉(zhuǎn)化率急劇降低，而且反應(yīng)器內(nèi)生物多樣性也會大幅度減少。然而，在硫化物存在的情況下SRB的活性較產(chǎn)甲烷菌（Methanogenic bacteria，MPB）高，是由于絮狀厭氧污泥比顆粒污泥對硫化物的抑制更敏感［42]；Sipma等［43]發(fā)現(xiàn)體系中硫化物的增加，MPB活性逐漸消失，而SRB仍具有電子供體的利用能力，其中MPB活性消失的原因是硫化物的毒性抑制。

2.4 供體競爭

在低ORP的環(huán)境中，SRB和其他微生物之間存在電子供體競爭關(guān)系，包括MPB和產(chǎn)乙酸菌（Acetogenic bacteria，AB），這些競爭關(guān)系中一些重要方程式列于表2中。當(dāng)硫酸鹽過量的情況下，SRB比MPB有較優(yōu)的生長速率、底物親和力、細(xì)胞產(chǎn)率。Meulepas等［44]發(fā)現(xiàn)SRB對氫的親和力高于MPB，即使在低氫分壓下SRB的活性也強(qiáng)于MPB；任榮等［45]發(fā)現(xiàn)反應(yīng)系統(tǒng)中ORP的降低，可提高M(jìn)PB對SRB的H2競爭。

表2 硫酸鹽還原、甲烷產(chǎn)生及產(chǎn)乙酸鹽反應(yīng)方程式［46]

在以H2/CO2為電子供體時(shí)，污泥停留時(shí)間（Sludge retention time，SRT）對厭氧污泥中SRB、MPB和AB之間H2競爭有影響。Weijma等［47]認(rèn)為增加SRT會影響SRB與MPB的H2競爭，且較長的SRT會使AB 和SRB的共生形式比MPB更具有優(yōu)勢；Sipma 等［43]研究發(fā)現(xiàn)增加SRT僅推遲MPB與SRB的競爭，而不影響最終的競爭結(jié)果，且較長的SRT對MPB、SRB和AB無顯著影響。

在以CO為能源時(shí)，水力停留時(shí)間（Hydraulic retention time，HRT）將決定SRB在反應(yīng)中競爭H2的優(yōu)勢。Sipma等［48]發(fā)現(xiàn)較長的HRT不利于SRB電子供體的競爭。在控制HRT為3 h時(shí)，SRB較MPB占優(yōu)勢，硫酸鹽還原速率為17 mmol·L-1d-1，超過87%的H2生產(chǎn)用于硫酸鹽還原；4 h時(shí)，其能夠消耗反應(yīng)器內(nèi)95%的H2，硫酸鹽還原速率較3 h時(shí)高；當(dāng)HRT上升至49 h時(shí)，MPB成為H2消耗的主導(dǎo)［49]，而SRB得不到足夠的電子供體，導(dǎo)致硫酸鹽還原速率下降。然而較短的HRT會使反應(yīng)器內(nèi)SRB生物量降低，這顯然會導(dǎo)致電子供體利用率、硫酸鹽轉(zhuǎn)化速率降低，表明足夠的生物量是實(shí)現(xiàn)更高的硫酸鹽轉(zhuǎn)化速率的先決條件［28，49]。Van Houten等［28]向反應(yīng)器中添加浮石顆粒等載體材料促使SRB生物量增加，但MPB在載體中的附著能力也強(qiáng)。

3 氣體特性及代謝轉(zhuǎn)化行為

3.1 CO毒性抑制

CO具有毒性會抑制SRB的生長。Van Houten等［23，28]以H2/CO2/CO的氣體混合物作為電子供體和碳源來評估CO對SRB的影響發(fā)現(xiàn)，在H2/CO2培養(yǎng)下，生物聚集體的外表面具有“毛狀”結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入CO后外表面上的毛狀結(jié)構(gòu)消失且變得光滑，微生物的附著能力、生長速率、硫酸鹽還原能力降低。Pandelia和Greco等［50-51]研究發(fā)現(xiàn)在CO培養(yǎng)下的厭氧菌存在氫化酶抑制作用。Parshina等［16，52]發(fā)現(xiàn)當(dāng)CO濃度達(dá)20%以上時(shí)，SRB氧化H2電子供體所需的時(shí)間增加，表明CO對SRB氫化酶存在抑制作用。然而Sipma等［43]發(fā)現(xiàn)SRB生化反應(yīng)器內(nèi)CO濃度的增加，乙酸鹽不斷生成，但氫化酶在乙酸生成中起著核心作用，表明CO對氫化酶的抑制不太可能是SRB受CO抑制的唯一原因。

3.2 CO代謝轉(zhuǎn)化

由于CO對SRB具有毒性抑制，因此能利用CO為唯一電子供體的微生物較少。Van Houten等［28]、Sokolova等［14]研究表明SRB 在較高CO 濃度下不能在聚集體的外部區(qū)域存活，且能利用CO生長的微生物數(shù)量較少。然而Parshina等［16]發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌D.kuznetsovii和D.thermobenzoicumsubsp.thermosyntrophicum均能在較高CO濃度下生長。D.kuznetsovii能耐受20% CO濃度，當(dāng)超過20%CO進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)，其硫酸鹽轉(zhuǎn)化率、H2S產(chǎn)量顯著下降，體系中乙酸鹽隨著CO濃度的增加而增加；D.thermosyntrophicum能耐受高達(dá)70% CO濃度，當(dāng)CO濃度超過70%時(shí)，其硫酸鹽轉(zhuǎn)化率、H2S產(chǎn)量降低，體系中乙酸鹽先增加后降低（表3）是由于CO濃度的增加，硫酸鹽還原受到抑制而產(chǎn)生大量乙酸鹽，受到CO毒性抑制的D.thermobenzoicum不能轉(zhuǎn)化和利用CO，導(dǎo)致其利用體系中的乙酸鹽進(jìn)行還原反應(yīng)。

部分微生物可直接利用CO進(jìn)行生長。Parshina等［15]報(bào)道Carboxydothermu hydrogenoformans將 CO代謝轉(zhuǎn)化為H2進(jìn)行生長，其不具有硫酸鹽還原能力；SRB可與這種微生物共培養(yǎng)來降低CO的毒性抑制（表 3）。Parshina和 Sipma等［16，52-53]發(fā)現(xiàn)脫硫腸狀菌屬D.carboxydivorans不僅能進(jìn)行硫酸鹽還原，還能實(shí)現(xiàn)對CO的代謝轉(zhuǎn)化。當(dāng)存在硫酸鹽的情況下，D.carboxydivorans將CO代謝轉(zhuǎn)化為H2，該H2又被用于硫酸鹽還原且最大硫酸鹽還原速率為0.3 mmol/h；當(dāng)不存在硫酸鹽時(shí)，該菌屬仍能實(shí)現(xiàn)對CO的代謝轉(zhuǎn)化［12，53]。

3.3 代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

CO由厭氧污泥內(nèi)產(chǎn)氫群體（如D.carboxydivorans）代謝轉(zhuǎn)化為H2和CO2，H2的存在會降低CO轉(zhuǎn)化率。據(jù)Sipma等［53]發(fā)現(xiàn)CO/H2比率決定著SRB對CO的代謝轉(zhuǎn)化，H2的增加會降低CO被代謝轉(zhuǎn)化的速率。CO被代謝轉(zhuǎn)化成的H2在厭氧污泥中也存在著競爭關(guān)系。Sipma等［43]發(fā)現(xiàn)在CO存在情況下，厭氧污泥中MPB對H2的競爭強(qiáng)于SRB，而AB的競爭能力弱于SRB。當(dāng)硫酸鹽還原或產(chǎn)甲烷作用占H2消耗主導(dǎo)時(shí)，能被AB利用的氫電子流通常很小，以致于AB不能與MPB或SRB競爭，產(chǎn)生這種競爭結(jié)果的原因可能是產(chǎn)乙酸作用需要相對較長的時(shí)間［42，53]，當(dāng)HRT遠(yuǎn)低于AB的倍增時(shí)間時(shí)，反應(yīng)器內(nèi)AB活性低、H2競爭能力弱。在CO培養(yǎng)的厭氧污泥中，需盡量減少M(fèi)PB對電子供體的消耗來提高硫酸鹽還原。Sipma等［17]發(fā)現(xiàn)在較高溫度（60和65℃）下，SRB活性比MPB強(qiáng)，但溫度較高會影響污泥中產(chǎn)氫群體對CO的代謝轉(zhuǎn)化；Vallero等［49]發(fā)現(xiàn)在高鹽度情況下，MPB比SRB的H2競爭能力強(qiáng)；Parshina等［52]發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH低于5.8時(shí)，SRB的H2競爭能力較MPB強(qiáng)，但轉(zhuǎn)化CO的產(chǎn)氫菌屬將不能生長。

表3 D.kuznetsovii和D.thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum對不同濃度的一氧化碳（CO）+氫/二氧化碳（H2/CO2）+硫酸鹽（SO4）的H2S轉(zhuǎn)化

4 小結(jié)

含硫酸鹽廢水的生化處理較傳統(tǒng)物化處理具有多重優(yōu)勢，而氣體作為SRB代謝過程的電子供體相較傳統(tǒng)有機(jī)碳源也具有顯著優(yōu)勢。綜上所述，氣體作為SRB電子供體在代謝機(jī)理、影響因素、毒性氣體（CO）的還原轉(zhuǎn)化等方面已有相應(yīng)的研究，其具有重要的理論意義和指導(dǎo)價(jià)值。但氣體作為電子供體在含硫酸鹽廢水的生化處理工程應(yīng)用中仍有諸多難題亟待解決。氣體傳質(zhì)對于SRB還原能力的提升至關(guān)重要，而H2、CO為難溶性氣體，其溶于水體供SRB利用的效率較低，因此難溶性氣體在生化系統(tǒng)中的傳質(zhì)阻力及效率提升還需深入研究，新型增溶擴(kuò)散膜材料及電解產(chǎn)氫電極材料可能是有潛力的技術(shù)方向。CO可作為SRB良好的電子供體，其具有較強(qiáng)毒性導(dǎo)致大多數(shù)SRB受抑制而未能發(fā)揮還原能力，且CO對生化代謝過程的毒性抑制機(jī)理尚不明確，其抑制機(jī)理及解除策略還有待深入研究。在代謝反應(yīng)過程中，SRB存在生物增殖、競爭能力減弱等問題，為有力促進(jìn)SRB在含硫酸鹽廢水處理中的工程應(yīng)用，可考慮SRB的高效增殖、代謝活性保持、目標(biāo)代謝產(chǎn)物的定向調(diào)控等研究。