李慧 查建軍 孫慶業(yè)

（安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230601）

作為生物生長(zhǎng)所需的大量元素之一，氮在土壤中的含量、賦存形態(tài)直接影響著作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而土壤中氮的含量、賦存形態(tài)又與土壤微生物密切相關(guān)，土壤是微生物的大本營(yíng)。土壤微生物不僅種類(lèi)多、數(shù)量大，且功能多樣［1]，通過(guò)參與土壤中的氮代謝過(guò)程共同驅(qū)動(dòng)土壤氮元素生物地球化學(xué)循環(huán)［2]。

早期關(guān)于土壤中氮轉(zhuǎn)化微生物的研究主要基于分離、培養(yǎng)等手段［3]，這種研究方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且難以深入了解土壤中參與氮代謝過(guò)程不同步驟微生物的豐度及機(jī)制。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為深入了解微生物參與土壤中氮代謝過(guò)程提供了有效手段，基于分子生物學(xué)技術(shù)目前已對(duì)與氮代謝有關(guān)的土壤微生物中的固氮基因（nifH）［4-6]、氨氧化基因（amoA-AOA、amoA-AOB）［7-10]、反硝化基因（nirS、nirK和nosZ）［11-13]、厭氧氨氧化基因（HZO）［14-15]等進(jìn)行了深入的研究。研究發(fā)現(xiàn)土壤中氮轉(zhuǎn)化功能基因的多樣性及豐度可以作為指示土壤中氮元素循環(huán)有效指標(biāo)，揭示土壤中氮素的循環(huán)過(guò)程［16]。

土壤中參與氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度的影響因素多種多樣，如偏酸性土壤中氨氧化微生物以amoAAOA為主［17]；低pH的酸性環(huán)境有利于nirS基因表達(dá)，而抑制nirK基因的表達(dá)［18]；較高濃度的有效氮抑制固氮基因nifH的表達(dá)［5，19]；影響HZO基因豐度的環(huán)境因素也多種多樣［20]，水稻土溶氧量不足時(shí)，鐵錳氧化物促進(jìn)厭氧氨氧化基因表達(dá)［21]；重金屬促進(jìn)或抑制性影響土壤中氮轉(zhuǎn)化功能基因表達(dá)［22-23]；剖面深度不同功能基因豐度不同等［24]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于土壤氮轉(zhuǎn)化功能基因的研究多集中于農(nóng)田表層土壤或沉積物中的某一類(lèi)功能基因［4-15]，而對(duì)極端環(huán)境下氮轉(zhuǎn)化多種類(lèi)型功能基因及其相互關(guān)系的研究開(kāi)展較少［25-26]。土壤中的氮循環(huán)是涉及多類(lèi)功能基因的一個(gè)連續(xù)過(guò)程，僅僅了解其中的某一類(lèi)功能基因難以深入了解土壤中氮循環(huán)過(guò)程及其影響因素。

酸性礦業(yè)廢水（Acid mine drainage，AMD）具有低pH、高鹽、高重金屬含量的特點(diǎn)［27]，大量的酸性礦業(yè)廢水進(jìn)入農(nóng)田后不僅導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降、糧食減產(chǎn)，也對(duì)土壤微生物以及土壤中的氮元素生物地球化學(xué)循環(huán)造成影響［28]。本研究以安徽省銅陵市某處受AMD污染的農(nóng)田作為研究對(duì)象，基于分子生物學(xué)技術(shù)，測(cè)定受AMD污染的土壤剖面中微生物量及參與氮轉(zhuǎn)化的功能基因豐度，探討AMD污染與土壤剖面氮代謝功能基因的關(guān)系，旨為深入了解酸性礦業(yè)廢水污染農(nóng)田土壤中的氮循環(huán)特點(diǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究區(qū)概況 研究區(qū)位于安徽省銅陵市某礦區(qū)附近受來(lái)自該礦酸性礦業(yè)廢水污染的稻田（N 30°58'26″，E 118°4'35″）， 該 地 土 壤 長(zhǎng) 期 受 硫 鐵礦排放的AMD污染，對(duì)照稻田（N 30°58'38″，E 118°4'15″）則一直使用正常水源灌溉。該地區(qū)為亞熱帶氣候，無(wú)霜期有237-258 d，年平均氣溫16.2℃，平均濕度在75%-81%之間，年均降雨量1 346 mm，雨季集中于 7-9 月［27]。

1.1.2 樣品采集 供試稻田包括2塊，一塊受硫鐵礦排放的AMD污染、另一塊未受AMD污染（對(duì)照）。2017年4月在每塊稻田各設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)，呈梅花狀分布，每個(gè)采樣點(diǎn)利用PVC管（內(nèi)徑5 cm）分別采集0-10 cm、10-20 cm、20-40 cm、40-60 cm、60-80 cm和80-100 cm土壤剖面樣本。野外采集的土壤樣本經(jīng)充分混勻后裝入滅菌的密封袋，然后置于4℃冰盒保存。返回室內(nèi)后，除部分新鮮樣用于氨氮、硝氮含量測(cè)定和分子生物學(xué)試驗(yàn)外，其余樣品于室內(nèi)風(fēng)干，研磨過(guò)篩后用于土壤pH、總氮、有機(jī)質(zhì)和重金屬含量分析。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化分析方法 pH值用pH計(jì)測(cè)定（土壤∶去離子水=1 g∶5 mL），總氮（TN）利用總有機(jī)碳分析儀（島津TOC-L）測(cè)定；氨氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3

--N）分別采用苯酚-次氯酸鈉比色法、紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定；硫采用X-射線(xiàn)衍射光譜分析法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用燒失量法測(cè)定；土壤重金屬含量采用鹽酸-氫氟酸消解后，用原子吸收分光光度計(jì)（耶拿 ContrAA?700）測(cè)定。

1.2.2 總DNA提取及功能基因豐度測(cè)定 微生物總DNA提取采用CTAB法提?。?7]，DNA 樣品用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后置于零下20℃冷凍保存。參與氮轉(zhuǎn)化的功能基因用上下引物在PCR儀里擴(kuò)增后得到標(biāo)準(zhǔn)品，引物序列見(jiàn)（表1）。經(jīng)擴(kuò)增后純化并嵌入到pEASY-T3克隆載體（全式金，中國(guó)北京）中，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到Trans1-T1 phage-resistant chemically competent cell（全式金，中國(guó)北京）。從陽(yáng)性克隆中抽提出的質(zhì)粒被用來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行熒光PCR（qPCR）定量，測(cè)定土壤剖面中功能基因的豐度。

qPCR定量反應(yīng)在ABI step-one system擴(kuò)增儀上根據(jù)KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。qPCR熒光定量反應(yīng)體系總體積為20.0 μL ：10 μL TaKaRa SYBRFAST qPCR Kit Master Mix（TaKaRa Biosystems，USA）；上下游引物（10 μmol/L） 各 0.5 μL， 樣 品 DNA 模 板 2 μL，7 μL ddH2O。以不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在熒光PCR定量?jī)x器里進(jìn)行采集熒光反應(yīng)。產(chǎn)物的特異性用溶解性曲線(xiàn)以及凝膠電泳確定。qPCR的擴(kuò)增效率是80%-90%，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的R2＞0.99。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析方法 SPSS 20.0軟件用于平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤、單因素方差分析、多因子方差分析（MANOVA）和雙變量相關(guān)分析（Pearson）等的計(jì)算，顯著性水平P＜0.05、P＜0.01作為顯著性、極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)；Origin 8.0軟件用于趨勢(shì)線(xiàn)的繪制。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

根據(jù)相關(guān)的儀器和方法測(cè)定受AMD污染土壤的理化性質(zhì)，結(jié)果如下：土壤pH為4.7-5.9，整體呈酸性，而未污染區(qū)土壤酸堿性整體呈中性；總氮含量為287.27-943.78 mg/kg，高于未污染區(qū)11.41%；氨氮含量為1.78-13.77 mg/kg，低于未污染區(qū)6.35%；硝氮1.84-5.73 mg/kg，高于未污染區(qū)55.45%；有機(jī)質(zhì)含量為5.10%-5.78%，與未污染區(qū)的土壤有機(jī)質(zhì)含量相似；S的含量為147.4-653.2 mg/kg，高于未污染區(qū)93.02%；Fe2O3為3.58%-5.75%，高于未污染區(qū)20.27%。土壤中的總氮、氨氮、硝氮、有機(jī)質(zhì)含量有隨剖面深度而降低的趨勢(shì)，而Fe2O3隨剖面深度的增加而富集。

2.2 土壤中細(xì)菌和古菌的數(shù)量

表1 研究所用引物及序列表

本研究中，每克干土的細(xì)菌和古菌16S 豐度分別為 3.01×1013-5.80×1013copies 和 4.30×1011-9.06×1011copies，表明所研究土壤剖面中細(xì)菌數(shù)量高于古菌（圖1）。污染和對(duì)照的土壤剖面中，0-20 cm表層土壤細(xì)菌的數(shù)量均顯著高于其他各層（P＜0.0），剖面0-80 cm范圍內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量基本上呈現(xiàn)出隨著剖面深度的增加而降低的趨勢(shì)。不同于細(xì)菌，盡管污染和對(duì)照土壤剖面中古菌數(shù)量也隨著剖面深度增加而降低，但整個(gè)剖面中古菌生物量的降低速率則相對(duì)較慢。與未受AMD污染的土壤剖面相比，受AMD污染的0-80 cm土壤剖面深度中細(xì)菌的生物量顯著降低，而古菌僅在20-60 cm的剖面中數(shù)量顯著降低（圖1）。

圖1 AMD污染和對(duì)照土壤剖面中的細(xì)菌和古菌

表2 土壤剖面中參與N轉(zhuǎn)化的功能基因豐度（copies/g，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=5）

2.3 土壤中氮代謝功能基因豐度

從表2可以看出，污染和對(duì)照稻田土壤剖面中不同功能基因的豐度隨剖面深度變化呈不同的趨勢(shì)。在AMD污染的土壤剖面中，0-10 cm范圍內(nèi)的nifH、nosZ和HZO的豐度顯著高于其下的其他各層（P＜0.05）， 而amoA-AOA、amoA-AOB、nirS、nirK等功能基因的相對(duì)豐度盡管相差一個(gè)數(shù)量級(jí)，但統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明并未呈現(xiàn)出顯著差異；對(duì)照稻田土壤剖面中，表層0-10（20）cm范圍內(nèi)所測(cè)定的7個(gè)功能基因的豐度均顯著高于其下的其他各層（P＜0.05）。

對(duì)比AMD污染土壤和對(duì)照土壤剖面同一層次的相同功能基因的豐度可以看出，AMD污染土壤10-80 cm剖面中nifH基因豐度顯著小于對(duì)照區(qū)，0-40 cm剖面中的amoA-AOB的豐度也低于對(duì)照區(qū)；而剖面中nirS（10-100 cm）和HZO（40-100 cm）則表現(xiàn)為相反的變化。上述結(jié)果表明，AMD對(duì)土壤剖面中功能基因nifH、nirS、amoA-AOB和HZO的影響較為顯著。

AMD污染稻田土壤剖面中，參與氨氧化的功能基因（amoA-AOA、amoA-AOB）則表現(xiàn)為amoAAOA的相對(duì)豐度高于amoA-AOB，而參與反硝化的功能基因（nirS、nirK）總體上表現(xiàn)為nirK相對(duì)豐度高于nirS。這表明amoA-AOA和nirK在AMD污染稻田土壤剖面的氨氧化和反硝化作用中扮演著更為重要的角色。

3 討論

3.1 影響剖面中細(xì)菌和古菌數(shù)量的主要因素

利用16S rDNA基因豐度作為指標(biāo)表征土壤中細(xì)菌和古菌數(shù)量目前已得到廣泛應(yīng)用［29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否受到AMD污染，土壤剖面中細(xì)菌和古菌的數(shù)量均隨著剖面深度的增加而降低，且同一層次中細(xì)菌的數(shù)量高于古菌；AMD污染剖面中細(xì)菌和古菌的數(shù)量均顯著低于未受污染的對(duì)照土壤，上述結(jié)果在其他研究中也得到證實(shí)［24，27]。研究表明，土壤剖面中微生物數(shù)量隨著深度增加而逐漸降低主要與養(yǎng)分（如有機(jī)質(zhì)、總氮、氨氮和硝氮等）及溶解氧含量逐漸降低有關(guān)［24，30]，本研究中土壤總氮和硝氮含量與剖面中細(xì)菌、古菌的豐度均呈極顯著的正相關(guān)（r總氮-細(xì)菌=0.615，P≤ 0.01；r總氮-古菌=0.525，P≤ 0.01；r硝氮-細(xì)菌=0.367，P≤ 0.01；r硝氮-古菌=0.425，P≤ 0.01），而土壤的細(xì)菌數(shù)量高于古菌的原因可能是由于細(xì)菌相對(duì)于古菌具有更多的代謝種類(lèi)和營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型，能夠適應(yīng)更多、更復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境［31]。AMD污染的土壤剖面中細(xì)菌和古菌數(shù)量低于對(duì)照剖面則主要由于較高的重金屬含量所導(dǎo)致［22]，相關(guān)分析表明剖面中細(xì)菌和古菌豐度與土壤中鐵的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r鐵-細(xì)菌=-0.456，P≤ 0.01；r鐵-古菌=-0.390，P≤ 0.01），說(shuō)明隨酸性礦業(yè)廢水而來(lái)的鐵進(jìn)入土壤導(dǎo)致了其中細(xì)菌和古菌數(shù)量降低。盡管剖面深度和重金屬含量均能導(dǎo)致土壤中細(xì)菌和古菌數(shù)量降低，但相對(duì)古菌而言（P=0.248）剖面深度對(duì)細(xì)菌數(shù)量的影響更為顯著（P=0.000）（表 3）。

表3 影響N轉(zhuǎn)化功能基因豐度因素的多因子方差分析

3.2 影響剖面中氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度的主要環(huán)境因子

土壤中功能基因的豐度不僅受土壤微生物群落的種類(lèi)組成和生物量影響［24]，還受到諸多環(huán)境因子的影響。相關(guān)分析表明，剖面中細(xì)菌豐度與nifH、amoA-AOA、amoA-AOB和nosZ呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.492、0.366、0.457和0.779），古菌豐度與amoA-AOA、amoA-AOB、nosZ和HZO也呈顯著或極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.569、0.270、0.673和0.476），多因素方差分析也表明（表3）剖面深度主要影響n(yōu)ifH、amoA-AOA、amoA-AOB和nosZ的豐度，深度對(duì)幾種功能基因豐度的影響主要與細(xì)菌和/或古菌的豐度變化有關(guān)。

本研究所分析的7個(gè)功能基因中，受AMD污染的農(nóng)田土壤剖面中nifH、nirS、amoA-AOB和HZO的豐度存在顯著差異；多因素方差分析也發(fā)現(xiàn)，AMD污染對(duì)nifH、nirS、nirK、amoA-AOB和HZO產(chǎn)生極顯著影響（P＜ 0.01，表3）。本研究中，導(dǎo)致農(nóng)田土壤污染的酸性礦業(yè)廢水來(lái)自于一處廢棄的硫鐵礦，低pH、高的硫酸根和鐵含量是該酸性礦業(yè)廢水的主要特點(diǎn)。雙變量相關(guān)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，pH與nifH和amoA-AOB呈極顯著的正相關(guān)，而與nirS、amoA-AOA以及HZO呈極顯著負(fù)相關(guān)；總硫的含量則與nosZ、amoA-AOA以及HZO呈極顯著的正相關(guān)，而鐵則表現(xiàn)出極顯著的負(fù)相關(guān)（表4）。

表4 剖面土中N轉(zhuǎn)化功能基因與理化性質(zhì)的相關(guān)性

amoA-AOB及amoA-AOA是驅(qū)動(dòng)土壤中好氧氨氧化的功能基因。本研究中，受AMD污染稻田土壤中不僅具有較高的amoA-AOA豐度，同時(shí)氨氧化古菌的數(shù)量也顯著高于氨氧化細(xì)菌（表2），表明受AMD污染的稻田中好氧氨氧化過(guò)程主要與氨氧化古菌有關(guān)，這一結(jié)果在其他的研究中也有發(fā)現(xiàn)［17，24]。研究表明，在中性和石灰性土壤中，氨氧化微生物在數(shù)量上以amoA-AOB為主導(dǎo)，在酸性土壤中以amoA-AOA 為主導(dǎo)［17，32]，這也就解釋了本研究中pH對(duì)amoA-AOB及amoA-AOA相對(duì)豐度有著截然不同的影響。鐵和硫與amoA-AOA的相關(guān)性也是截然相反的（表4），鐵與amoA-AOA之間的負(fù)相關(guān)性可能與鐵與古菌之間的顯著性負(fù)相關(guān)，AMD污染土壤剖面中鐵的增加導(dǎo)致古菌豐度降低（r鐵-古菌=-0.390，P≤0.01），伴隨著古菌數(shù)量的降低源于古菌的amoA-AOA豐度也相對(duì)降低；而硫與amoAAOA極顯著正相關(guān)，可能與硫酸鹽還原作用-氨氧化作用之間的耦合有關(guān)［33]，本研究中氨氧化功能基因amoA-AOA豐度與參與硫酸鹽還原的dsrB功能基因豐度（數(shù)據(jù)在表2中未展示）之間呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)（r=0.364，P≤0.01）。由于氨氧化古菌是AMD污染稻田中好氧氨氧化過(guò)程的主要參與者，因此本研究中總氮和硝氮含量與amoA-AOA豐度之間的正相關(guān)性是容易理解的，這種關(guān)系也被其他的研究所證實(shí)［10]。

在整個(gè)反硝化過(guò)程中，nirS和nirK是將亞硝酸鹽還原為NO的功能基因［32]，是反硝化作用的標(biāo)志性反應(yīng)，也是最重要的限速步驟；而功能基因nosZ則將N2O 還原為N2，是反硝化作用的最后一步。研究發(fā)現(xiàn)，土壤理化性質(zhì)如pH、質(zhì)地及含氮量等是微生物反硝化過(guò)程的重要影響因素［24，32]。本研究中，AMD對(duì)土壤剖面中功能基因nirS的影響較為顯（P＜0.05），而對(duì)nirK、nosZ等功能基因豐度的影響則相對(duì)較小或不產(chǎn)生影響，AMD污染土壤中nirS基因豐度顯著性大于未污染區(qū)（表2）。Samad等［18]也發(fā)現(xiàn)，酸性土壤環(huán)境更有利于nirS基因表達(dá)。盡管有研究發(fā)現(xiàn)nosZ對(duì)pH的變化十分敏感［32]，但本研究中nosZ豐度與pH之間并無(wú)顯著相關(guān)性?？偟拖醯欠聪趸^(guò)程的電子受體，已經(jīng)得到廣泛證明［32]，本研究中土壤總氮和硝氮僅與nosZ具有極顯著的正相關(guān)性，而與nirS和nirK并無(wú)顯著相關(guān)性（表4），這些結(jié)果表明，總氮和硝氮對(duì)反硝化過(guò)程及其基因的影響在不同的環(huán)境條件下存在有顯著的差異性。

厭氧氨氧化（Anammox）過(guò)程是土壤中的微生物通過(guò)調(diào)控功能基因HZO將亞硝酸鹽和NH4+氧化為N2，影響該過(guò)程的環(huán)境因素包括pH、溶解氧、NO等［20]，同時(shí)剖面深度和土壤質(zhì)地也對(duì)HZO功能基因豐度產(chǎn)生影響［34]。本研究中，pH、Fe2O3和有機(jī)質(zhì)含量與HZO呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)。Anammox過(guò)程是一個(gè)消耗H+的過(guò)程［15]，AMD污染條件下較酸的土壤環(huán)境可能促進(jìn)了Anammox的進(jìn)程；水稻土溶解氧不足時(shí)，鐵錳氧化物因充當(dāng)有機(jī)質(zhì)降解的氧化劑需消耗H+進(jìn)行鐵氨氧化［21]，這可能是導(dǎo)致鐵有機(jī)質(zhì)含量與HZO呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)主要原因。

nifH作為固氮作用的標(biāo)志性功能基因主要來(lái)自固氮細(xì)菌，這些固氮細(xì)菌多偏好酸堿度為中性的土壤環(huán)境［6]，土壤中較高的硝態(tài)氮含量對(duì)nifH產(chǎn)生不利影響，抑制了nifH功能基因的表達(dá)［5]，較高的有機(jī)質(zhì)含量在提供固氮細(xì)菌生長(zhǎng)需要的同時(shí)，豐富的電子傳遞系統(tǒng)也有利于提高nifH基因的豐度與表達(dá)［24]。

土壤剖面中功能基因豐度除了受到營(yíng)養(yǎng)狀況和污染物含量影響外，還受到剖面深度的影響。表3可以看出，剖面深度主要影響n(yōu)ifH、amoA-AOA、amoA-AOB和nosZ的豐度，深度對(duì)幾種功能基因豐度的影響，一方面可能是隨著深度增加細(xì)菌和古菌的數(shù)量逐漸降低；另一方面隨著深度增加溶解氧及養(yǎng)分也逐漸降低，深度對(duì)功能基因豐度的影響在其他的研究中也被證實(shí)［24]。

4 結(jié)論

隨著剖面深度的增加，稻田土壤剖面中細(xì)菌和古菌數(shù)量以及參與N轉(zhuǎn)化的部分功能基因豐度逐漸降低，AMD污染導(dǎo)致土壤剖面中細(xì)菌和古菌的數(shù)量顯著降低，但古菌數(shù)量隨剖面深度下降的速度低于細(xì)菌；AMD對(duì)土壤剖面中功能基因nifH、nirS、amoA-AOB和HZO的影響較為顯著，在AMD污染土壤剖面中amoA-AOA和nirK在氨氧化和反硝化作用中扮演著更為重要的角色；酸性礦業(yè)廢水污染導(dǎo)致的pH降低及總硫和總鐵含量的增加是導(dǎo)致土壤剖面氨氧化和反硝化作用變化的主要原因。