王亞妮 宋金龍 韓剛 穆迎春 江旭 王金耀 阮志勇 李樂

（1. 上海海洋大學(xué)，上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；4. 巴彥淖爾市第一中學(xué)，巴彥淖爾 015002）

孔雀石綠是一種常見的三苯甲烷類染料，廣泛的運(yùn)用在紡織印染工業(yè)中，又由于其對(duì)魚類水霉病等病害具有良好控制效果，在我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中曾長(zhǎng)期作為漁藥使用［1-2]。20世紀(jì)70年代以來，大量的報(bào)道證實(shí)孔雀石綠具有潛在的致畸、致癌和致突變作用，在水產(chǎn)品中的殘留會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成威脅。鑒于孔雀石綠的危害性，我國(guó)明確將孔雀石綠列為禁用藥［3-4]。但由于價(jià)格低廉、殺菌效果好等原因，仍有少量不法商販?zhǔn)褂?。加之孔雀石綠在自然環(huán)境中殘留期長(zhǎng)、不易降解，因此，開發(fā)一種孔雀石綠高效降解方法具有十分重要的意義［5]。

微生物降解是目前公認(rèn)的處理難降解有機(jī)物最有效的辦法之一，也被證實(shí)是處理孔雀石綠污染的有效方式。房桂華等［6]分離到一株能以孔雀石綠為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的菌株Arthrobactersp.M6. 該菌12 h內(nèi)對(duì)20 mg/L的孔雀石綠降解率高于80%。梅嬛等［7]報(bào)道了一株孔雀石綠降解菌Raoultellasp. K4-W在48 h內(nèi)對(duì)20 mg/L的孔雀石綠降解率為82.5%。吳永利等［8]研究報(bào)道在LB培養(yǎng)基中，菌株P(guān)seudomonassp.KL-1在6 h內(nèi)，可以使100 mg/L的孔雀石綠幾乎完全脫色，降解最適溫度為30℃，菌株在pH為7-14范圍能很好地降解孔雀石綠，脫色率均能達(dá)到72%以上。綜上所述，目前已有一些高效孔雀石綠降解菌，但高降解率均是在LB培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)的，LB培養(yǎng)基碳氮源豐富，無法代表菌株的實(shí)際降解效果。為了進(jìn)一步分離到高效降解菌，本研究采用未培養(yǎng)結(jié)合可培養(yǎng)篩選的方法，以期獲得以孔雀石綠為唯一碳源的高效的孔雀石綠降解菌，為該類化合物在環(huán)境中的修復(fù)提供優(yōu)良的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試樣品采自浙江省杭州市某化工廠廢水處理池的活性污泥，采集后裝入無菌樣品瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于孔雀石綠降解菌的分離。

1.1.2 主要試劑 供試孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich，純度為 ≥98.5%；甲醇和乙腈等為色譜純，購(gòu)自賽默飛世爾公司。實(shí)驗(yàn)用水為高純水與蒸餾水。

1.1.3 培養(yǎng)基 MSM培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO41.5，KH2PO40.5，NH4Cl 1，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7。Luria-Bertani LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 降解菌群的富集 將10 g活性泥樣品加入乘有100 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，以100 mg/L孔雀石綠為唯一碳源，在轉(zhuǎn)速150 r/min，30℃搖床上振蕩30 min培養(yǎng)7 d，后按10%（V/W）接入新鮮無機(jī)鹽培養(yǎng)基，并調(diào)整孔雀石綠濃度至200 mg/L，連續(xù)傳代直至富集物中的孔雀石綠濃度達(dá)到300 mg/L，將每個(gè)代次的富集培養(yǎng)物分別命名為JW1、JW2 和 JW3［9]。

1.2.2 富集培養(yǎng)物微生物群落組成和區(qū)系變化分析 對(duì)活性污泥樣品和3個(gè)代次的富集培養(yǎng)物進(jìn)行了總DNA提取，方法參照MOBIO Power Soil土壤總DNA試劑盒說明書步驟進(jìn)行。采用16S rRNA V4-V5區(qū)通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)總DNA進(jìn)行了擴(kuò)增。PCR體系（50 μL）為：上下游引 物（10 mmol） 各 2 μL，DNA（20 ng/μL）3 μL，2×Premix Taq 25 μL，Nuclease-free water 20 μL。PCR反應(yīng)條件 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃40 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止。PCR產(chǎn)物純化回收后，采用DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB）進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，后交（美格基因科技公司）對(duì)構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行 PE2500 測(cè)序。獲得測(cè)序結(jié)果后進(jìn)行運(yùn)算分類單位（Operational taxonomic units，OTU）物種注釋，從而得到每個(gè)樣品的群落組成信息，結(jié)合物種豐度信息，通過 PCoA、NMDS 等排序分析，比較不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異。

1.2.3 孔雀石綠降解菌的分離 根據(jù)富集培養(yǎng)高通量測(cè)序獲得的菌種信息，選擇第三代富集樣品進(jìn)行稀釋涂布于含有50 mg/L孔雀石綠的MSM固體平板上，挑選形態(tài)不一樣的菌落進(jìn)行劃線，并且以同樣的平板多次劃線純化。

1.2.4 孔雀石綠降解菌的初步鑒定 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒（Omega）提取菌株的基因組DNA，并以此為PCR擴(kuò)增模板，采用細(xì)菌16S rRNA通用 引 物 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-ACGGHTACCTTGTTTACGACTT-3'） 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）為：上下引物各0.5 μL， 模 板 2 μL，Taq PCR Mix12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為 1 500 bp 左右。將PCR產(chǎn)物送于博邁德有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 孔雀石綠降解菌的能力測(cè)定 將分離到的菌株接種于MSM培養(yǎng)基中，于 30℃、150 r/min 的恒溫振蕩器培養(yǎng)12-24 h后，將富集培養(yǎng)的菌液，在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心6 min后，棄上清液，菌體用0.9% NaCl生理鹽水，洗滌3次，以1%接種量加入含有50 mg/L孔雀石綠的MSM培養(yǎng)基中，研究降解菌對(duì)孔雀石綠的降解效果。檢測(cè)采用高效液相色譜方法，具體檢測(cè)條件為：色譜柱Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；紫外波長(zhǎng) 600 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相：乙腈/乙酸銨緩沖溶液（85∶15，V∶V）；流速 0.6 mL/min，柱溫 35℃［10-11]。依據(jù)檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm處孔雀石綠的峰面積結(jié)果，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出培養(yǎng)液中孔雀石綠濃度，再根據(jù)降解率計(jì)算公式（降解率=（初始濃度-終濃度）/初始濃度×100%）計(jì)算降解能力［12]。

1.2.6 菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定 通過可見分光光度計(jì)測(cè)定，以波長(zhǎng)λ=600 nm 處的吸光度表示，將培養(yǎng)好菌液離心后用無菌水洗滌 1-2 次，然后懸浮于等量的生理鹽水中測(cè)定OD600nm值［13]。

1.2.7 降解特性研究 設(shè)置不同溫度（15、20、25、30、35、40 和 45），pH（4、5、6、7、8 和 9）， 不同接種量（1×107、2×107、3×107、5×107、8×107和10×107CFU/mL），研究不同條件對(duì)菌株JW3-6降解50 mg/L孔雀石綠能力的影響。

2 結(jié)果

2.1 孔雀石綠降解菌群多樣性和區(qū)系變化分析

經(jīng)過連續(xù)傳代2次，富集物中的孔雀石綠濃度達(dá)到了300 mg/L，將每個(gè)代次的富集培養(yǎng)物分別命名為JW1、JW2和JW3，污泥樣品命名為JWY，分別提取了4個(gè)樣品的總DNA并進(jìn)行了16S rRNA V4-V5區(qū)擴(kuò)增，運(yùn)用Illumina Hiseq2500平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序和OTU（Operational taxonomic units）物種注釋。結(jié)果（圖1）表明JWY樣品中的序列聚類到1 568個(gè)OTUs，屬水平上菌群主要分屬于Flavobacterium、Pseudomonas、Arenimonas、Methylotenera、Dechloromonas、Geobacter、Labrys，分別占總OTUs的27.37%、9.39%、4.7%、3.2%、1.64%、1.51%和0.16%（圖1）。經(jīng)過1次傳代的富集培養(yǎng)物JW1 中序列聚類到967個(gè)OTUs。在屬水平上菌群主要分屬于Pseudomonas、Methylotenera、Methylobacillus、Acinetobacter和Labrys， 分 別 占51.14%、33.17%、2.43%、1.46%和0.3%。2次傳代樣品JW2序列聚類到576個(gè)OTUs，在屬水平上菌群主要分屬于Pseudomonas、Labrys、Acinetobacter、Achromobacter和Cupriavidus，分別占總OTUs的54.7%、21.5%、10.4%、2.67%和1.6%。3次 傳 代JW3樣品78 458個(gè)16S rDNA序列聚類到396個(gè)OTUs。在屬水平上，菌群主要分屬于Pseudomonas、Labrys、Acinetobacter、Cupriavidus、Achromobacter、Mesorhizobium和Methylobacillus，分別占總OTUs的67.8%、14.6%、7.9%、2.7%、1.7%、0.09%和0.71%。

從結(jié)果（圖2）中可以看出，隨著富集代次的增加和孔雀石綠濃度的提高，富集培養(yǎng)中的微生物多樣性逐漸降低，從原始樣品的1 568個(gè)OTUs降至396個(gè)，群落組成也發(fā)生了明顯的變化。優(yōu)勢(shì)菌屬?gòu)某跏嫉腇lavobacterium變?yōu)镻seudomonas，經(jīng)2次傳代后OTUs總數(shù)占比達(dá)67.8%，說明Pseudomonas菌屬與孔雀石綠的降解密切相關(guān)，F(xiàn)lavobacterium菌屬經(jīng)1次傳代后OTUs占比就降低至0.1%以下。而原本占總OTUs比僅為0.16%的Labrys，OTUs上升至14.6%，說明Labrys也是參與孔雀石綠降解的主要菌群。此外，Acinetobacter、Cupriavidus、Achromobacter菌屬經(jīng)2次傳代后OTUs占比逐漸升高，也很可能與孔雀石綠的降解相關(guān)。

2.2 降解單菌的分離鑒定

經(jīng)連續(xù)劃線純化，從富集培養(yǎng)物JW3中分離到13株對(duì)孔雀石綠具有降解效果的菌株，其中JW3-6和JW3-5效果較好，降解率分別為91.2%和67.8%，顯著高于其他菌株，最終選擇降解效果最好的JW3-6進(jìn)行后續(xù)研究。菌株JW3-6在LB平板上菌落呈乳白色，表面光滑，邊緣整齊。在顯微鏡下，菌體形狀為桿狀，革蘭氏染色陰性。將菌株JW3-6 的16S rRNA 基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登錄號(hào)為MK494181，BLAST結(jié)果表明，JW3-6與Pseudomonasveronii16S rRNA 基因的相似性為99.69%，根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3可以看出，菌株JW3-6與假單胞菌數(shù)的菌株匯聚在一起，因此初步將JW3-6鑒定為Pseudomonas veronii。

2.3 菌株JW3-6降解孔雀石綠特性分析

菌株JW3-6能以孔雀石綠為唯一碳源生長(zhǎng)，從降解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出，如圖4，孔雀石綠的降解率與菌株JW3-6的菌體濃度呈正相關(guān)，主要的降解發(fā)生在1-3 d，4 d后降解效率逐漸降低，菌體生長(zhǎng)到達(dá)平穩(wěn)期，經(jīng)過7 d后，JW3-6對(duì)初始濃度為50 mg/L的孔雀石綠降解達(dá)到了91.2%。

2.4 溫度對(duì)JW3-6降解效率的影響

圖 3 JW3-6 16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

從圖5中可以看出菌株JW3-6具有良好的溫度適應(yīng)范圍，可以在15-45℃的區(qū)間內(nèi)降解孔雀石綠，其中30℃降解效率最高，達(dá)到了92.3%，當(dāng)溫度為45℃時(shí)，降解率為42.2%。當(dāng)溫度降低至15℃時(shí)，降解率為50.2%。由此可見，菌株JW3-6具有較好的溫度適應(yīng)范圍。

圖 4 孔雀石綠降解率與菌株JW3-6菌體濃度正相關(guān)圖

圖 5 溫度對(duì)JW3-6降解效率的影響

2.5 pH對(duì)JW3-6降解效率的影響

菌株JW3-6可以在pH為4-9的范圍內(nèi)降解孔雀石綠，如圖6所示，在pH為5-7的范圍內(nèi)降解效率均超過80%，pH為7時(shí)降解效率最高，為92.5%。菌株JW3-6在偏堿性的條件下降解效率較低，當(dāng)pH升高至8時(shí)，降解效率即下降至65.5%，在pH為9時(shí)，降解效率為34.5%，說明菌株在偏酸性條件下降解效果較好。

圖 6 pH對(duì)JW3-6降解效率的影響

2.6 接種量對(duì)JW3-6降解效率的影響

研究了不同初始接種量對(duì)菌株降解孔雀石綠的影響，如圖7所示，初始接種量1-5×107CFU/mL的范圍內(nèi)降解效率均超過80%，接種量為5×107CFU/mL時(shí)降解效率最高，為92.8%。菌株JW3-6在接種量增加的條件下降解效率無明顯變化，當(dāng)接種量增加為8×107CFU/mL時(shí)降解效率為85%，10×107CFU/mL時(shí)降解效率為76.5%。由此可見，初始接種量對(duì)菌株JW3-6降解孔雀石綠的影響較小。

圖 7 接種量對(duì)JW3-6降解效率的影響

3 討論

近年來，研究人員已從土壤、湖泊及廢水處理池等各類環(huán)境樣品中分離到可脫色或降解孔雀石綠的微生物，涉及細(xì)菌、放線菌及真菌中不同的屬種。已報(bào)道的細(xì)菌和放線菌如庫(kù)特氏菌屬（Kurthia）［14]、芽孢桿菌屬（Brevibacillus）［15]、腸桿菌屬（Enterobacter）［16]、拉烏爾菌屬（Raoultella）［17]及假單胞菌屬（Pseudomonas）［18-19]。吳永利等［8]研究報(bào)道在LB培養(yǎng)基中，菌株P(guān)seudomonassp.KL-1在6 h內(nèi)，可以使得100 mg/L 的孔雀石綠幾乎完全被脫色。Tao等［20]研究中篩選到Pseudomonassp.YB2甚至能夠?qū)? 000 mg/L的孔雀石綠，12 h內(nèi)完全降解脫色，但該2個(gè)菌株的降解率均是在LB培養(yǎng)基條件下實(shí)現(xiàn)的，在實(shí)際環(huán)境中很難達(dá)到同等效果。本研究以孔雀石綠為唯一碳源，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基當(dāng)中篩選的JW3-6菌體可以對(duì)50 mg/L孔雀石綠的降解效率達(dá)到92.8%，為孔雀石綠污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供了優(yōu)良的菌株。

以往有關(guān)孔雀石綠降解菌的報(bào)道中，大多采用傳統(tǒng)的分離篩選方法，通常對(duì)樣品直接富集馴化和定向分離降解微生物，本研究結(jié)合未培養(yǎng)與可培養(yǎng)的方法，首先對(duì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得樣品當(dāng)中主要的微生物組成信息，分析了不同代次孔雀石綠降解富集物中微生物群落變化發(fā)現(xiàn)，可能與孔雀石綠降解相關(guān)的菌株，如Labrys菌屬原本占總OTUs升至14.6%，說明Labrys很可能參與了孔雀石綠降解；菌 種Acinetobacter、Cupriavidus、Achromobacter在 兩次傳代中OTUs占比呈升高趨勢(shì)，推測(cè)也與孔雀石綠降解有關(guān)系。運(yùn)用高通量測(cè)序的方法獲得降解菌群群落組成，直接獲得可能與降解孔雀石綠相關(guān)的微生物菌種，有目的地篩選，最終得到13株可能具有降解孔雀石綠高效的降解菌株，其中以假單胞菌降解效率最高，結(jié)合可培養(yǎng)的方式得到目的菌株JW3-6。此方法更具有高效性和針對(duì)性，為其他環(huán)境污染物降解過程中微生物分離提供參考。

4 結(jié)論

通過高通量測(cè)序分析了不同代次孔雀石綠降解富集物中微生物群落變化，確定了優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞菌，進(jìn)一步分離到了高效孔雀石綠降解菌，經(jīng)初步鑒定為PseudomonasveroniiJW3-6，7 d內(nèi)對(duì)孔雀石綠降解效率最高為92.8%。通過單因素試驗(yàn)確定了該菌最適的降解條件為30℃，pH 7，初始接種量5.0×107CFU/mL。